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1. Iniezione stereotassica di elettronica mesh nel cervello di topo vivo
NOTA: I topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale con una miscela di 75 mg/kg di ketamina e 1 mg/kg di dexdomitor. Il grado di anestesia è stato verificato con il metodo del pizzicamento delle dita dei piedi prima di iniziare l'intervento chirurgico. La temperatura corporea è stata mantenuta posizionando il topo su una coperta omeotermica a 37 °C durante l'anestesia. Per l'intervento chirurgico è stata implementata un'adeguata tecnica sterile, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'autoclavaggio di tutti gli strumenti chirurgici in metallo per 1 ora prima dell'uso, l'uso di guanti sterilizzati, l'uso di uno sterilizzatore a perline calde durante l'intervento, il mantenimento di un campo sterile intorno al sito chirurgico, la disinfezione degli strumenti di plastica con etanolo al 70% e la pelle depilata del cuoio capelluto è stata preparata con iodoforo prima dell'incisione. Per gli interventi chirurgici di sopravvivenza, dopo la conclusione dell'intervento, è stata applicata una pomata antibiotica intorno alla ferita e il topo è stato riportato in una gabbia dotata di un termoforo a 37 °C. I topi non venivano lasciati incustoditi fino a quando non avevano riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Ai topi è stata somministrata analgesia con buprenorfina tramite iniezione intraperitoneale alla dose di 0,05 mg/kg di peso corporeo ogni 12 ore per un massimo di 72 ore dopo l'intervento chirurgico. I topi sono stati isolati da altri animali dopo l'intervento chirurgico. I topi sono stati soppressi tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital alla dose di 270 mg/kg di peso corporeo o tramite perfusione transcardica.
- Anestetizzare il mouse e fissarlo in un fotogramma stereotassico.
- Applicare lubrificante oculare sugli occhi del topo per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Usa un trapano dentale e una cornice stereotassica per aprire una craniotomia alle coordinate desiderate sul cranio. Aprire una seconda craniotomia lontano dal sito di iniezione per l'inserimento di una vite o di un filo di messa a terra in acciaio inossidabile.
- Fissare un substrato di serraggio al cranio con cemento dentale. Tagliare uno spazio largo circa 1 mm nel substrato per migliorare l'affidabilità della fase di piegatura più avanti nella procedura.
NOTA: Un cavo piatto flessibile (FFC) tagliato a forma di "L" funziona bene (Figura 4A), anche se molti materiali funzionerebbero purché abbiano lo spessore corretto per il connettore ZIF (Zero Insertion Force) a 32 canali (progettato per cavi di spessore 0,18 ± 0,05 mm).
- Montare il portapipetta con l'ago contenente l'elettronica a rete sul telaio stereotassico utilizzando un morsetto terminale ad angolo retto (Figura 2C e Figura 3A).
- Collegare l'uscita laterale del supporto della pipetta a una siringa da 5 ml fissata in una pompa a siringa (Figura 3D) utilizzando un tubo capillare lungo circa 0,5-1 m.
NOTA: Assicurarsi che non vi siano bolle nel tubo capillare prima di collegarlo al supporto della pipetta. Le bolle possono interrompere il flusso durante l'iniezione e impedire un'erogazione regolare e controllata dell'elettronica a rete.
- Utilizzare il telaio stereotassico per posizionare la punta dell'ago nella posizione di partenza desiderata all'interno del cervello.
NOTA: Le sonde elettroniche a rete utilizzate qui sono progettate con elettrodi di registrazione distribuiti su una lunghezza di circa 2 mm e con il primo elettrodo situato a circa 0,5 mm dal bordo iniziale dell'elettronica a rete (bordo più a sinistra in Figura 1A). Per questo motivo, le coordinate stereotassiche dovrebbero essere selezionate in modo tale che la posizione di partenza sia 0,5 mm più profonda della regione cerebrale di interesse. La diffusione e la posizione degli elettrodi di registrazione all'interno dell'elettronica a rete possono essere selezionate liberamente durante il processo di progettazione della maschera e devono essere selezionate in modo che gli elettrodi di registrazione si estendano sulle regioni cerebrali di interesse mentre vengono iniettati lungo la loro traiettoria stereotassica.
- Posizionare la fotocamera (Figura 3B) per visualizzare la parte superiore della sonda elettronica mesh all'interno dell'ago di vetro. Alcuni software consentono all'utente di tracciare una linea sullo schermo per segnare la posizione originale dell'elettronica mesh.
- Avviare il flusso impostando la pompa a siringa a bassa velocità e premendo Start. 10 mL/h è una tipica portata iniziale per un ago capillare con diametro interno di 400 μm. Aumentare lentamente la portata se la sonda elettronica a rete non si muove all'interno dell'ago.
NOTA: È importante ridurre al minimo il volume di liquido iniettato nel cervello in quanto ciò può danneggiare il tessuto che circonda il sito di iniezione. I migliori risultati si ottengono con volumi di iniezione inferiori a 25 μl per 1 mm di lunghezza della maglia iniettata. I valori ideali sono meno della metà di questo volume; Nel nostro laboratorio, in genere iniettiamo 10-50 μl per una lunghezza della maglia iniettata di 4 mm.
- Quando la sonda elettronica mesh inizia a muoversi all'interno dell'ago, utilizzare il telaio stereotassico per ritrarre l'ago alla stessa velocità con cui viene iniettata la sonda elettronica mesh, utilizzando la posizione originale contrassegnata dell'elettronica mesh come guida.
NOTA: Questa procedura, chiamata metodo di iniezione del campo visivo (FoV), consente la consegna precisa dell'elettronica mesh a una regione cerebrale mirata senza accartocciamento o dislocazione. Spesso la portata può essere ridotta una volta che la sonda dell'elettronica mesh inizia a muoversi all'interno dell'ago. Nel nostro laboratorio, sono spesso necessarie portate di 20-30 mL/h per superare l'attrito statico tra la rete e le pareti dell'ago capillare, ma la velocità può essere ridotta a 10 mL/h una volta avviato il processo di iniezione. Le portate e i volumi di iniezione sono generalmente inferiori per gli aghi capillari di diametro inferiore.
- Continua a far scorrere la soluzione salina e a ritrarre l'ago fino a quando l'ago non è uscito dal cranio. Arrestare il flusso dalla pompa a siringa.
2. Interfacciamento input/output
NOTA: A questo punto, la sonda elettronica a maglie è stata iniettata dal punto di partenza desiderato all'interno del cervello lungo la traiettoria scelta. L'ago è stato retratto e si trova appena sopra la craniotomia con le interconnessioni elettroniche a rete che si estendono dal cervello all'ago e i pad di input/output (I/O) ancora all'interno dell'ago (Figura 4B). Questa sezione utilizza un circuito stampato (PCB; Figura 4, Figura 5) per interfacciarsi con la sonda elettronica mesh. Il PCB collega un connettore ZIF a un connettore di amplificazione standard a 32 canali attraverso un substrato isolante che diventa lo stadio principale per gli esperimenti di registrazione neurale. Il PCB è personalizzabile per adattarsi a varie configurazioni dello stadio principale. I nostri file di progettazione sono disponibili su richiesta o dal sito Web delle risorse, meshelectronics.org, e possono essere utilizzati per acquistare PCB a basso costo da fornitori di servizi di produzione e assemblaggio di PCB.
- Utilizzare il telaio stereotassico per guidare con cura l'ago verso il substrato di serraggio FFC e attraverso lo spazio, facendo scorrere la soluzione con la pompa a siringa per generare allentamento nelle interconnessioni elettroniche a rete (Figura 4C).
- Una volta che l'ago si trova sopra il substrato di serraggio e attraverso lo spazio, riprendere il flusso a una velocità elevata per espellere le piazzole I/O dell'elettronica mesh sul substrato di serraggio (Figura 4D).
- Utilizzando una pinzetta e una pipetta di acqua deionizzata (DI), piegare i pad I/O a un angolo di circa 90° il più vicino possibile al primo pad I/O.
NOTA: La piegatura è necessaria per consentire l'inserimento dei pad nel connettore ZIF su un PCB in un passaggio successivo. Il connettore ZIF ha esattamente la stessa larghezza dei 32 pad I/O della sonda elettronica mesh, quindi una curva imperfetta di 90°, o una piega che non si verifica subito prima del primo pad I/O, comporterà la necessità di tagliare i pad I/O (i pad più a sinistra in Figura 4E).
- Una volta che i pad I/O sono allineati, aperti e con un angolo di 90° rispetto allo stelo della rete, asciugarli in posizione con aria compressa che scorre delicatamente.
NOTA: Le sonde elettroniche mesh con meno di 32 canali possono essere interfacciate con la stessa scheda di interfaccia a 32 canali. Ad esempio, il nostro laboratorio utilizza comunemente sonde elettroniche mesh a 16 canali con PCB a 32 canali. Ciò fornisce spazio aggiuntivo all'interno del connettore ZIF, facilitando l'interfacciamento, e i canali incontattati aggiuntivi sono facilmente identificabili come circuiti aperti mediante test di impedenza durante le sessioni di registrazione.
- Tagliare il substrato di serraggio su un bordo dritto a circa 0,5-1 mm dal bordo delle piazzole I/O. Tagliare anche le parti estranee del substrato di serraggio che ostacoleranno l'inserimento nel connettore ZIF a 32 canali montato su PCB (Figura 4F).
- Inserire le piazzole di I/O nel connettore ZIF sul PCB e chiudere il fermo (Figura 4G). Utilizzare l'elettronica di misurazione per misurare l'impedenza tra i canali e la vite di messa a terra per confermare la corretta interfaccia. Se i valori di impedenza sono troppo alti, sbloccare il connettore ZIF, regolare l'inserimento e ripetere il test fino a quando non viene confermato il collegamento riuscito.
- Coprire il connettore ZIF e le interconnessioni elettroniche a rete esposta con cemento dentale per protezione. Capovolgere il PCB in corrispondenza della fessura nel substrato e fissare il PCB con del cemento sul cranio del topo (Figura 4H).
NOTA: Piegare l'FFC in corrispondenza della fessura riduce la sollecitazione meccanica che a volte può rompere le interconnessioni elettroniche mesh.
- Lasciare indurire il cemento, trasformando il PCB in un head-stage robusto e compatto per l'interfacciamento durante le successive sessioni di registrazione (Figura 4I).
3. Esperimenti di registrazione neurale
- Posizionare il mouse in un tailveiner o in un altro sistema di contenzione. Inserire il PCB del preamplificatore nel connettore dell'amplificatore standard sul PCB dell'headstage. Utilizzare un cavo separato per mettere a terra la vite di riferimento.
- Per le registrazioni trattenute, lasciare il mouse nel sistema di ritenuta. Registrare i dati utilizzando il sistema di acquisizione dati per il periodo desiderato (Figura 5A).
- Per registrazioni in movimento libero, rilasciare il mouse dal fermo dopo aver inserito il preamplificatore PCB e messo a terra la vite di riferimento. Registrare per il periodo di tempo desiderato utilizzando il sistema di acquisizione dati mentre il mouse si comporta liberamente (Figura 5B)
