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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Soluzioni
- Soluzione di affettatura
- Fare riferimento alla Tabella 1 per la composizione della soluzione per affettare.
- Preparare in anticipo una soluzione madre 20x e conservarla a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Per la soluzione da affettare 1x, sciogliere NaHCO3, glucosio e saccarosio in ddH2O e aggiungere il brodo 20x. Assicurarsi che l'osmolarità sia compresa tra 315 e 320 mOsm e conservare la soluzione per non più di 1 settimana a 4 °C.
- Riempire due becher con 100 mL di soluzione per affettare e coprirli con parafilm. Raffreddare la soluzione in congelatore fino a quando non diventa parzialmente congelata (circa 20 minuti in congelatore a -80 °C). Utilizzando un tubo di dispersione del gas, far bollire entrambi i becher della soluzione di affettatura con il 95% di O2/5% di CO2 per 20 minuti con ghiaccio.
- aCSF (liquido cerebrospinale artificiale), per il recupero e il mantenimento delle fette
- Fare riferimento alla Tabella 1 per la composizione dell'aCSF.
- Preparare in anticipo una soluzione madre 20x e conservarla a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Per 1x aCSF, sciogliere NaHCO3 e glucosio in ddH2O e aggiungere il brodo 20x. Assicurarsi che l'osmolarità sia compresa tra 298 e 300 mOsm. Utilizzare la soluzione entro 1 giorno.
- aCSF (basso Ca2+ per la registrazione)
- Fare riferimento alla Tabella 1 per la composizione del basso Ca2+ aCSF.
- Preparare in anticipo una soluzione madre 20x e conservarla a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Per 1x basso Ca2+ aCSF, sciogliere NaHCO3 e glucosio in ddH2O e aggiungere 20x (CaCl2 e MgCl2 free), CaCl2 e MgCl2 stock alle concentrazioni specificate. Assicurarsi che l'osmolarità sia compresa tra 298 e 300. Utilizzare la soluzione entro 1 giorno.
- aCSF (Sr2+ per la registrazione)
- Fare riferimento alla Tabella 1 per la composizione dell'aCSF Sr2+.
- Preparare in anticipo una soluzione madre 20x e conservarla a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Per 1x Sr2+ aCSF, sciogliere NaHCO3 e glucosio in ddH2O e aggiungere 20x (CaCl2 e MgCl2 free), SrCl2 e MgCl2 alle concentrazioni specificate. Assicurarsi che l'osmolarità sia compresa tra 298 e 300. Utilizzare la soluzione entro 1 giorno.
- Soluzione interna
- Fare riferimento alla Tabella 1 per la composizione della soluzione interna a base di K-gluconato.
- Per ottenere 20 ml di soluzione interna, aggiungere 15 ml di acqua di biologia molecolare a una provetta da 50 ml. Quindi, esegui i passaggi successivi sul ghiaccio.
- Preparare le seguenti soluzioni in anticipo a concentrazioni di 1 M in acqua di biologia molecolare. Aggiungere (in mL): 2,32 K-gluconato, 0,24 Na-gluconato, 0,20 HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfofonico), 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA (Potassio etilenglicol-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N',N′-acido tetraacetico), 0,04 MgCl2 alla provetta da 50 mL.
- Aggiungere 100 μl di 0,3 M Na3GTP (sale sodico di guanosina 5′-trifosfato)
- Pesare 44,08 mg di K2 ATP (sale di adenosina 5'-trifosfato dipotassico) in una provetta da microcentrifuga da 2 ml e aggiungere 1 ml di acqua di biologia molecolare, quindi aggiungere in una provetta da 50 ml.
- Regolare il pH a 7,2-7,4 con 1 M KOH. Assicurarsi che l'osmolarità sia compresa tra 283 e 289 mOsm.
2. Preparazione della fetta
- Preparare gli strumenti
- Aggiungere 200 mL di aCSF alla camera di recupero (costituita da un becher da 250 mL con 4 pozzetti e rete) e porre la camera di recupero in un bagno d'acqua (35 °C).
- Coprire la camera con un film di paraffina e far bollire costantemente l'aCSF con il 95% di O2/5% di CO2 utilizzando un tubo di dispersione di vetro per almeno 20 minuti.
- Prepara gli strumenti di dissezione (bisturi, forbici sottili angolate, pinze, pennello fine, cucchiaio di plastica).
- Riempire una siringa da 60 ml con circa 15 ml della soluzione per affettare ghiacciata del passaggio 1.1.4.
- Preparare la piattaforma di dissezione posizionando la carta da filtro sul coperchio di una piastra a pozzetti.
- Preparare la camera di affettatura mettendola nella vaschetta del ghiaccio e riempiendola di ghiaccio.
- Impostare il vibratomo fissando una lama usa e getta nel portalama.
- Per fare una pipetta di trasferimento, rompi la punta di una pipetta Pasteur e posiziona un bulbo di gomma sull'estremità rotta.
- Sezionare il cervello del topo
- Anestetizzare l'animale in una camera satura di isoflurano al 4% fino all'assenza dei riflessi spinali.
- Decapita l'animale usando una ghigliottina e rimuovi rapidamente il cervello.
- Praticare un'incisione sulla linea mediana con una lama di bisturi n. 22 dal rostrale al caudale.
- Lateralmente, sbucciare il cuoio capelluto su ciascun lato della testa.
- Usa le forbici sottili per tagliare il cranio su un lato da caudale a rostrale (compreso il lato delle ossa frontali), facendo attenzione a non danneggiare il cervello.
- Usa una pinza per sollevare il pezzo di cranio dal cervello e raffreddare rapidamente il cervello con 15 ml di soluzione per affettare ghiacciata usando la siringa del passaggio 2.1.4.
- Solleva il cervello dal cranio.
- Mettere il cervello in uno dei becher riempiti con soluzione per affettare ghiacciata (dal passaggio 1.1.4) gorgogliata con il 95% di O2/5% di CO2.
3. Prepara fette di ipotalamo di topo.
- Bloccare il cervello per l'area cerebrale desiderata e l'angolo di taglio (ad esempio, per le fette di ipotalamo coronale, tagliare il tessuto rostrale al chiasma ottico e caudale al ponte usando una lama e assicurarsi che il blocco caudale abbia una superficie piana perpendicolare alla base del cervello).
- Usando un pezzo di carta da filtro tagliato, raccogli il cervello dal lato anteriore e incolla il lato posteriore alla piastra di supporto usando la colla istantanea.
- Posizionare rapidamente la piastra di supporto nella camera di affettamento e riempirla con la soluzione per affettare del secondo bicchiere al punto 1.1.4.
- Fissare la camera di affettatura e la vaschetta del ghiaccio sul vibratomo.
- Definisci l'area di taglio (anteriore e posteriore al cervello) e inizia ad affettare fette coronali di 250 μm di spessore. Parametri consigliati: velocità 0,10 mm/s, ampiezza 2 mm.
- Taglia le fette alla dimensione appropriata per l'area cerebrale desiderata.
- Recuperare le fette a 35 °C per 30-45 min. Quindi, rimuovere la camera di recupero dal bagno di riscaldamento e lasciare che le fette si riprendano a temperatura ambiente per altri 30 minuti. Conservare le fette a temperatura ambiente per il resto della giornata e continuare a bollire costantemente il bagno con il 95% di O2/5% di CO2.
3. Registrazione del Patch Clamp a Cellula Intera
- Estrarre le pipette del cerotto.
- Utilizzando i parametri suggeriti per la registrazione dell'intera cellula dal manuale dell'estrattore di pipette, estrarre le pipette patch dal vetro a pareti spesse fino a una resistenza della pipetta di 3-5 MΩ.
- Utilizzando una microsiringa (commerciale o fatta in casa), riempire un puntale per pipetta con una soluzione interna filtrata. Per realizzare una micro siringa, bruciare la punta di una siringa da 1 ml e lasciare che la punta cada, creando una punta lunga e sottile.
- Ottenere la configurazione a cella intera.
- Posizionare la pipetta di registrazione appena sopra la fetta e compensare la corrente della pipetta in modalità voltage clamp. Applicare una leggera pressione positiva sulla pipetta e bloccare il rubinetto.
- Selezionare una cellula sana con una membrana intatta e avvicinarla con la pipetta. La pressione positiva dovrebbe causare un leggero disturbo nel tessuto (cioè un'onda lenta nel tessuto quando si entra).
- Continuare lentamente ad avvicinare la pipetta alla cellula con un movimento diagonale fino a quando la pipetta non forma una piccola fossetta sulla superficie cellulare.
- Rilasciare il blocco della pressione positiva. La cella inizierà a formare un sigillo e la resistenza aumenterà oltre 1 GΩ. Nella pinza di tensione, tenere la cella a -68 mV.
- Tirare leggermente la cella in diagonale per rimuovere la pressione in eccesso dalla cella.
- Compensare la capacità della pipetta veloce e lenta.
- Applicare una breve aspirazione attraverso il tubo collegato al supporto della pipetta per aprire la cella e ottenere una configurazione a cella intera.
- Passa alla modalità Cell nella finestra di test della membrana in un software di acquisizione e analisi dei dati di elettrofisiologia (ad es. Clampex).
- Prima di ogni registrazione del morsetto di tensione, eseguire un test della membrana utilizzando lo stesso software e registrare i parametri rilevanti in un libro di laboratorio (resistenza della membrana, resistenza di accesso e capacità).
- Mantenere la temperatura del bagno di registrazione a 27-30 °C e la velocità di flusso a 1,5-2,0 mL/min per gli esperimenti successivi.
Tabella 1: La composizione di varie soluzioni.
| Concentrazioni di soluzione (mM) |
| affettamento | ACSF normale | Basso Ca2+ aCSF | Sr+ aCSF | Pipetta/Interna |
| NaCl | 87 | 126 | 126 | 126 | - |
| Kcl | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 8 |
| CaCl2 | 0,5 | 2.5 | 0,5 | - | - |
| SrCl2 | - | - | - | 2.5 | - |
| MgCl2 | 7 | 1.5 | 2.5 | 1.5 | numero arabo |
| NaH2PO4 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | - |
| NaHCO3 | 25 | 26 | 26 | 26 | - |
| glucosio | 25 | 10 | 10 | 10 | - |
| saccarosio | 75 | - | - | - | - |
| K-gluconato | - | - | - | - | 116 |
| Na-gluconato | - | - | - | - | 12 |
| HEPES | - | - | - | - | 10 |
| K2-EGTA | - | - | - | - | 1 |
| K2ATP | - | - | - | - | 4 |
| Na3GTP | - | - | - | - | 0,3 |