Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. pHuC_Mermaid Generazione di plasmidi
NOTA: Mermaid è un biosensore sviluppato accoppiando il dominio di rilevamento della tensione (VSD) del sensore di tensione Ciona intestinalis (ora Ciona robusta) contenente fosfatasi (Ci-VSP) con i fluorofori partner per il trasferimento di energia di risonanza della fluorescenza (FRET) Umi-Kinoko Green (mUKG: donatore) e una versione monomerica della proteina fluorescente che emette arancia Kusabira Orange (mKOk: accettore). Per questo biosensore, i cambiamenti conformazionali del dominio VSD, indotti dalla depolarizzazione della membrana, aumentano la prossimità delle proteine fluorescenti donatrici e accettori, aumentando così il trasferimento di energia tra di loro (aumentando il FRET Ratio). Il VSD assicura l'efficiente localizzazione del biosensore sulla membrana plasmatica. L'espressione neuronale del biosensore (nel midollo spinale, il segnale è rilevabile sia negli interneuroni che nei motoneuroni) è ottenuta clonando il Mermaid open reading frame (ORF) sotto il promotore pan-neurale del pesce zebra HuC.
- Amplificare mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) il telaio di lettura aperto Mermaid (ORF) dal plasmide Mermaid pCS4+ con Pfu (correzione di bozze) DNA polimerasi utilizzando il primer universale T3 e il primer Mermaid SmaI (5'TATCCCGGGATTCGACGACGGTTCAGATTTTA) al fine di inserire un sito di restrizione SmaI a monte dell'ORF Mermaid.
- Utilizzare la seguente miscela PCR: 0,5 μl di Pfu DNA polimerasi, 7,5 μl del tampone specifico 10x, 1 μl di 10 mM di deossinucleotide trifosfati (dNTP), 2,5 μl di dimetilsolfossido (DMSO), 0,5 μl (50 ng) del preparato plasmidico e 1 μl di soluzioni madre da 20 μM di ciascun primer in un volume totale di 50 μl.
- Riscaldare la miscela PCR per 15 s a 95 °C, adescarla per 15 s a 50 °C e allungarla per 4 min a 72 °C per un totale di 35 cicli.
- Purificare in gel il prodotto specifico per PCR blunt utilizzando un kit di purificazione in gel commerciale, seguendo il protocollo del produttore.
- Clonare il frammento di DNA nel vettore smussato pCMV-SC seguendo il protocollo del produttore.
- Linearizzare il plasmide Mermaid-positivo (denominato pCMV-SC_Mermaid) con l'enzima di restrizione SmaI per il successivo inserimento del promotore HuC.
- Impostare la reazione di restrizione come segue: 0,5 μL (10 U) di enzima di restrizione SmaI, 2 μL del tampone 10x del kit e 5 μg di DNA plasmidico in un volume totale di 20 μL. Incubare la reazione a 25 °C per 1 ora.
- Purificare con gel il plasmide digerito utilizzando un kit di purificazione in gel commerciale seguendo il protocollo del produttore.
- PCR-amplificare il promotore HuC (pHuC), con DNA polimerasi Pfu e DNA genomico di zebrafish come stampo, utilizzando una coppia di primer specifici per HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA e HuCprom-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) e coprendo una regione di 3.150 bp a monte dell'ATG.
- Impostare la miscela PCR utilizzando il seguente schema: 0,5 μL di Pfu DNA polimerasi, 7,5 μL del tampone specifico 10x, 1 μL di dNTP da 10 mM, 2,5 μL di DMSO, 200 ng di DNA genomico e 1 μL di soluzioni stock da 20 μM di ciascun primer in un volume totale di 50 μL.
- Dopo una fase iniziale di 2 minuti a 95 °C, riscaldare la miscela PCR per 15 s a 95 °C, adescarla per 15 s a 50 °C e allungarla per 4 min a 72 °C per un totale di 35 cicli.
- Purificare con gel il prodotto specifico per PCR blunt utilizzando un kit di purificazione in gel commerciale seguendo il protocollo del produttore.
- Ligare una quantità equimolare del pCMV-SC_Mermaid purificato (fase 1.5) e del DNA pHuC (fase 1.7) utilizzando 1 μL di DNA ligasi T4 e 1 μL del tampone specifico 10X in un volume totale di 10 μL. Incubare la reazione per 16 ore a 4 °C.
- Trasformare un'aliquota di cellule competenti con 5 μL della reazione di legatura (fase 1.8) seguendo le istruzioni del produttore.
- Selezionare i cloni pHuC-positivi (pHuC_Mermaid) con il promotore inserito nell'orientamento corretto mediante una doppia digestione Sal I-EcoRV (il sito di restrizione SalI è stato inserito a monte del frammento del promotore nella fase 1.6, mentre il sito di restrizione EcoRV è posizionato a valle della regione di poliadenilazione, PolyA, del plasmide pCMV-SC).
- Impostare la reazione di restrizione come segue: 0,5 μL (10 U) di entrambi gli enzimi di restrizione SalI ed EcoRV, 2 μL del tampone kit10X e 1 μg di DNA pHuC_Mermaid in un volume totale di 20 μL. Incubare la reazione a 37 °C per 1 ora. Eseguire le reazioni su un gel di agarosio.
2. Microiniezione di embrioni
- Trasferire le uova fecondate ottenute da pesce zebra adulto wild-type (ceppo AB) o Sod1-G93R in una capsula di Petri da 10 mm utilizzando una pipetta di plastica.
- Sciacquare gli embrioni in acqua di pesce fredda (4 °C) e microiniettarli immediatamente nel tuorlo con 200 pg di plasmide pHuC_Mermaid utilizzando un microiniettore (per una descrizione generale e dettagliata della procedura di microiniezione).
- Utilizzando una pipetta di plastica, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri e incubarli in acqua di pesce a 28 °C fino a raggiungere lo stadio di sviluppo desiderato (20-24 ore dopo la fecondazione, hpf) per le analisi successive.
3. Analisi dell'avvolgimento spontaneo della coda
NOTA: Valuta il comportamento spontaneo di avvolgimento della coda in embrioni 20-24 hpf con o senza il farmaco riluzolo.
- Trasferire un embrione in una capsula di Petri rotonda da 90 mm riempita con acqua di pesce contenente lo 0,2% di DMSO (veicolo riluzolo) e deteroionarlo manualmente utilizzando due pinze da gioielliere con punte affilate. Incubare l'embrione per 5 minuti.
- Rileva l'avvolgimento della coda a temperatura ambiente (RT) durante una registrazione video di 1 minuto utilizzando una fotocamera digitale montata su uno stereomicroscopio. Acquisisci serie temporali con una risoluzione temporale di 30 fotogrammi/s.
- Calcola la frequenza degli avvolgimenti spontanei della coda contando il numero di pieghe (sia controlaterali che omolaterali) per unità di tempo.
- Per valutare l'effetto del farmaco riluzolo, utilizzare delicatamente una pipetta di plastica Pasteur per trasferire l'embrione in una nuova piastra di Petri da 90 mm riempita con acqua di pesce contenente 5 μM di riluzolo.
- Incubare l'embrione per 5 minuti prima di registrare un video di 1 minuto ed eseguire l'analisi comportamentale come sopra.
4. Configurazione dell'imaging per la visualizzazione del biosensore Mermaid negli embrioni viventi: rilevamento simultaneo dei segnali del donatore e dell'accettore
- Montare gli embrioni da 20 a 24 hpf in agarosio all'1% a basso punto di fusione in acqua di pesce a 37 °C all'interno di una capsula di imaging con fondo di vetro da 35 mm. Orientare gli embrioni su un lato. Attendere che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente.
- Trasferire la piastra di imaging sul tavolino di un confocale invertito montato su un microscopio invertito. Identificare i motoneuroni che esprimono il biosensore con un obiettivo 20X (apertura numerica 0,7, NA) eccitando il mUKG con la linea laser ad argon a 488 nm e registrando la sua emissione tra 495 e 525 nm.
- Per una misurazione FRET, eccitare mUKG, il donatore della coppia FRET, con la linea laser a 488 nm. Rilevare simultaneamente, con uno scanner risonante operante a 8.000 Hz in modalità bidirezionale, la fluorescenza emessa dal donatore (tra 495 e 525 nm) e la fluorescenza emessa dall'accettore mKOk (tra 550 e 650 nm, canale FRET). Se disponibile, utilizzare il laser a 473 nm.
nota: L'efficienza di eccitazione del donatore sarà leggermente ridotta (85% invece del 93% con 488 nm), ma anche l'eccitazione crociata dell'accettore sarà ridotta (dal 17% con la linea laser a 488 nm al 9% con la linea laser a 473 nm).
- Per ridurre la fototossicità e lo sbiancamento dei fluorofori, ridurre al minimo l'illuminazione del campione riducendo la potenza della linea laser (sulla finestra del percorso del fascio del software di acquisizione).
- Ottimizza l'eccitazione in modo che corrisponda ai parametri di guadagno e offset impostati all'inizio dell'esperimento e mantenuti costanti per tutta la sessione. Per impostare l'offset, modificare il colore dell'immagine in valori di intensità (utilizzando la tabella di ricerca Q) e, durante la scansione con il laser spento, ruotare la manopola di offset (offset intelligente) in modo che i pixel di sfondo abbiano un'intensità leggermente superiore a zero. Con la stessa tabella di ricerca, accendendo il laser durante la scansione, ruotare la manopola del guadagno (guadagno intelligente) per massimizzare il rapporto segnale/rumore, facendo attenzione ad evitare pixel saturi.
- Utilizzando un foro stenoforico aperto (2 unità ariose), acquisire immagini a 16 bit per fornire una gamma dinamica sufficiente per analisi quantitative. Evitare la media per aumentare la velocità di acquisizione e ridurre al minimo il fotosbiancamento.
- Nella finestra di acquisizione del software, selezionare dal menu a discesa una dimensione del campo immagine di 512 x 64 pixel (dimensione dei pixel: 605 nm).
- Dalla finestra della modalità di acquisizione, selezionare xyt (time lapse on a single xy plane) dalmenu a tendina e registrare le variazioni di tensione del neurone spinale dell'embrione acquisendo un singolo piano xy, impostando i parametri di acquisizione per registrare un'immagine ogni 30 ms per 1 min.
- Per valutare l'effetto della somministrazione di riluzolo sulla depolarizzazione della membrana nello stesso neurone, acquisire un nuovo set di dati 5 minuti dopo l'aggiunta di acqua di pesce contenente 5 μM di riluzolo.
- Per l'analisi FRET, utilizzare il macro Biosensor_FRET ImageJ (che esprime biosensori FRET a catena singola).
- Valutare il rapporto FRET della membrana basale di ciascun neurone a t1 come ((FRET media - FRET background)/(Donor mean - Donor background)), dove FRET e Donor mean intensity è l'intensità media di fluorescenza calcolata nella stessa regione di interesse (ROI) disegnata attorno alla cellula per ciascun canale acquisito e FRET and Donor background è l'intensità media di fluorescenza calcolata in un ROI del campo visivo senza il campione fluorescente.
nota: Una descrizione dettagliata dell'uso del plug-in è disponibile sul sito web www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret.
- Utilizzare un software grafico per confrontare la frequenza, l'ampiezza e la durata della depolarizzazione tra diversi paradigmi sperimentali. Confronta due gruppi utilizzando un test t di Student non accoppiato e considera i valori medi come statisticamente diversi quando P <0,05.
