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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione degli animali e anestesia
- Indurre l'anestesia nel topo con isoflurano/inalazione di ossigeno. Utilizzare il 4% di isoflurano per l'induzione dell'anestesia e il 2-3% per il mantenimento a 2,5 L/min di flusso di ossigeno. Regolare la percentuale di isoflurano per il mantenimento dell'anestesia in base alle condizioni del topo, cioè i topi piccoli e deboli richiedono meno anestetici. Confermare un'anestesia adeguata, ad esempio applicando una leggera pressione sul tappetino da passeggio degli arti posteriori per verificare l'assenza di un riflesso di astinenza del dolore.
- Controllare la temperatura corporea del mouse utilizzando una piastra riscaldante termostatica a 37 °C per prevenire la diminuzione della temperatura corporea durante l'anestesia.
- Montare il mouse con l'ogiva per il mantenimento dell'anestesia. Assicurarsi che l'animale abbia un apporto sufficiente di ossigeno controllando che l'ogiva non ostruisca le vie respiratorie e che l'animale respiri costantemente.
- Durante la registrazione, monitorare se il topo è sufficientemente anestetizzato osservando la frequenza respiratoria (circa 1 Hz in anestesia) e l'assenza di un riflesso di ritiro a pressione lieve. Aumentare manualmente la concentrazione di isoflurano se l'anestesia non è abbastanza profonda.
- Dopo le misurazioni, lasciare il topo a riprendersi sulla piastra riscaldante o al calore di una lampada a infrarossi fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale, per circa 2-5 minuti. Non lasciare il topo incustodito e in compagnia di altri topi fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia.
2. Misurazione del CMAP negli arti anteriori
- Utilizzare gli elettrodi ad ago da 27 G per le misurazioni CMAP degli arti anteriori. Vedere la Figura 1 per le posizioni consigliate per il posizionamento degli elettrodi.
- Posizionare gli elettrodi sugli arti anteriori come segue.
- Posizionare il mouse sul termoforo in posizione supina e utilizzare del nastro adesivo per estendere entrambi gli arti anteriori ai lati del corpo (Figura 1B).
- Posizionare gli elettrodi stimolanti (1 = anodo e 2 = catodo) per via sottocutanea su entrambi i lati dell'arto anteriore per allinearli con il nervo del plesso brachiale. Sollevare la pelle per inserire l'ago perpendicolarmente attraverso la pelle e spingere circa 5 mm dell'ago sotto la pelle senza perforare i muscoli sottostanti.
- Posizionare l'elettrodo di registrazione (3) per via sottocutanea sopra il muscolo bicipite brachiale sollevando la pelle. Posizionare l'elettrodo di riferimento (4) sui pattini da passeggio a una profondità di 3 mm con un angolo di 30 gradi. Posizionare l'elettrodo di terra (5) per via sottocutanea sul lato del mouse.
nota: Gli elettrodi sono molto vicini l'uno all'altro in questa configurazione. Evitare che gli elettrodi si tocchino l'un l'altro in quanto ciò distorce la registrazione.
3. Acquisizione dati
- Avviare la stimolazione premendo il pulsante dello stimolo ricorrente nell'unità di controllo e ruotare la manopola del regolatore di intensità per aumentare lo stimolo. Stimolare tutti gli assoni utilizzando 1 impulso/s con una durata dello stimolo di 0,1 ms. Seleziona la frequenza e la durata corrette dai menu a discesa del software.
- Per raggiungere stimoli sopramassimali (5-20 mA; in condizioni demielinizzanti fino a 60 mA), applicare stimoli crescenti ruotando la manopola del regolatore di intensità fino a quando l'ampiezza della risposta CMAP cessa di aumentare. Da lì, aumentare ulteriormente lo stimolo del 20% per garantire che l'ampiezza del CMAP abbia raggiunto la sua risposta massima. Terminare la stimolazione premendo nuovamente il pulsante dello stimolo ricorrente.
- Utilizzare lo strumento marcatore per indicare i seguenti punti nella registrazione: inizio dello stimolo, inizio della risposta, picco positivo massimo e picco negativo massimo (Figura 2).
- Determinare la latenza (in ms) come ritardo dall'inizio dello stimolo all'inizio della risposta (Figura 2). Definisci l'inizio della risposta come il primo punto in cui l'ampiezza inizia ad aumentare. Utilizzare la latenza per valutare la demielinizzazione negli assoni.
- Misurare l'ampiezza (mV) dal picco massimo negativo a quello massimo positivo (Figura 2). Utilizzare l'ampiezza dell'ampiezza per correlare il numero di assoni funzionali.
