Registrazione elettrofisiologica delle risposte di tensione dei fotorecettori retinici di Drosophila agli stimoli luminosi

Abstract

Fonte: Juusola, M., et al. Metodo elettrofisiologico per la registrazione delle risposte di tensione intracellulari dei fotorecettori e degli interneuroni di Drosophila agli stimoli luminosi in vivo. (2016).

Questo video delinea il protocollo per la registrazione elettrofisiologica dell'attività dei fotorecettori nell'occhio di una Drosophila immobilizzata, consentendo una misurazione precisa delle variazioni di tensione in risposta agli stimoli luminosi.

Protocollo

1. Registrazione dai fotorecettori R1-R6

1. Essere sempre collegati a terra quando si utilizza l'amplificatore per microelettrodi (ad esempio toccando la superficie metallica della gabbia di Faraday o del tavolo antivibrante), in quanto ciò impedisce l'erogazione accidentale di una carica statica allo stadio principale, che potrebbe danneggiare i circuiti.
2. Illuminare l'asta della piattaforma di preparazione delle mosche dall'alto con due guide luminose a collo d'oca (Figura 1A) (con la fonte di luce fredda all'interno della gabbia di Faraday) in modo che il portamosche possa essere posizionato sul palo nella posizione preferita sotto stretto controllo visivo.
3. Montare il portamosche (con la mosca dentro!) sul palo della piattaforma di preparazione delle mosche. Ruotare il portamosche in modo che l'occhio sinistro della mosca sia direttamente rivolto verso l'investigatore (Figura 1B).
4. Inserire delicatamente l'elettrodo di riferimento smussato attraverso gli ocelli della mosca nella capsula della testa utilizzando un piccolo micromanipolatore grossolano mentre si osserva la preparazione attraverso lo stereomicroscopio (Figura 1C). Non spingere l'elettrodo troppo in profondità, poiché ciò può danneggiare il cervello del molo.
   1. In alternativa, inserire l'elettrodo di riferimento nella parte posteriore del torace. Assicurati sempre che la mosca appaia sana (muove le antenne) e che i suoi occhi siano intatti, non danneggiati accidentalmente. Se la preparazione sembra meno che immacolata, prepara una nuova mosca per gli esperimenti.
5. Inserire il microelettrodo di registrazione affilato nell'occhio sinistro attraverso una piccola apertura ricoperta di vaselina. Utilizzare un ingrandimento elevato nello stereomicroscopio e spostare le guide di luce e il piano focale in modo che la posizione della punta dell'elettrodo diventi evidente in 3D dai suoi modelli di riflettanza.
   NOTA: La Figura 1D mostra come dovrebbe essere posizionata la testa della mosca (rispetto all'angolo con cui il microelettrodo di registrazione entra nell'occhio) per le registrazioni dei fotorecettori. Piantare l'elettrodo nell'occhio senza romperlo è la fase più difficile dell'esperimento. Se la punta dell'elettrodo manca la piccola apertura nell'occhio, colpendo la cornea, in genere si rompe.
6. Accendere l'amplificatore del microelettrodo una volta che entrambi gli elettrodi sono saldamente all'interno del preparato, a contatto elettrico con i fluidi corporei della mosca.
7. Spegnere la fonte di luce fredda (all'interno della gabbia di Faraday) e scollegarla dalla rete elettrica. Collegare la sua spina alla messa a terra centrale per ridurre al minimo il rumore elettrico indotto dal loop di terra e allontanare le guide luminose a collo d'oca in modo che il sistema Cardan-arm possa essere spostato liberamente intorno alla mosca. Spegni le luci della stanza per assicurarti che la preparazione della mosca sia ora in relativa oscurità.
8. Misurare la resistenza dell'elettrodo di registrazione nell'occhio. Utilizzare solo elettrodi di registrazione in cui la resistenza è 100 - 250 MΩ.
   nota: Ottenere registrazioni intracellulari di alta qualità con un elettrodo da <70 MΩ è praticamente impossibile. Se la resistenza è <80 MΩ, è probabile che la punta dell'elettrodo sia rotta. In questo caso, spegnere l'amplificatore e sostituire l'elettrodo di registrazione.
9. Impostare l'amplificatore sulla modalità di registrazione a pinza di corrente (CC) o a ponte. Annulla qualsiasi differenza di tensione arbitraria tra gli elettrodi di registrazione e quelli di riferimento, poiché entrambi si trovano ora nello spazio extracellulare elettricamente interconnesso, impostando l'offset del segnale (tensione di registrazione) su zero. Seguire le modifiche dell'offset del segnale utilizzando la lettura del display dell'amplificatore o lo schermo di un oscilloscopio.
10. Attendi 2-3 minuti affinché l'occhio di mosca si adatti al buio.
11. Spingere la punta dell'elettrodo di registrazione più in profondità nell'occhio con piccoli incrementi da 0,1 a 1 micron. A tale scopo, è possibile utilizzare un piezo-stepper dell'asse x di un micromanipolatore telecomandato o ruotare delicatamente la manopola di risoluzione fine di un manipolatore manuale.
12. Stimolare l'occhio del moscerino con brevi lampi di luce (1 - 10 msec) mentre l'elettrodo di registrazione viene fatto avanzare nel tessuto.
    nota: Se l'elettrodo di registrazione è posizionato nella retina e l'occhio funziona normalmente, ogni lampo di luce causerà un breve e piccolo calo della tensione (0,2 - 5 mV di iperpolarizzazione), chiamato elettroretinogramma (ERG). Questo cambiamento nel potenziale di campo dello spazio extracellulare è causato dalla risposta collettiva delle cellule retiniche alla luce.

Risultati

Figura 1. Posizionamento del portamosche e degli elettrodi per gli esperimenti. (A-B) Il portamosche è posizionato sulla piattaforma di registrazione che fornisce anche il controllo della temperatura tramite un elemento Peltier (A: piattaforma rotonda bianca al centro). Il braccio di Cardano consente il posizionamento esatto dello stimolo luminoso a una distanza uguale (tramite rotazione x,y) attorno...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stereomicroscopio Zoom per la preparazione della mosca	Olimpo	Oculari PF SZX12 DFPLFL1,6x: WHN30x-H/22	Capace di ingrandimento ~150X con lunga distanza di lavoro; supporto da tavolo in acciaio pesante su misura
Stereomicroscopio in configurazione intracellulare	· Olimpo	Olympus SZX7; oculari: WHN30x-H/22	Gli oculari 30X sono necessari per vedere bene i riflessi della punta dell'elettrodo quando lo si fa passare attraverso il piccolo foro corneale nell'occhio
Microscopio Nikon	Nikon SMZ645; oculari: C- W30x/7
Tavolo antivibrante	Melles Griot	Con fori metrici M6 sulla breadboard	I nostri rig su misura hanno un grande foro praticato attraverso la spessa breadboard che consente l'ingresso dal basso del palo della piattaforma di preparazione al volo (ospita un dissipatore di calore in rame con elettronica)
Newport
Micromanipolatori	Narishige	Narishige NMN-21	Nelle nostre configurazioni intracellulari, vengono utilizzati diversi sistemi di micromanipolatori per guidare gli elettrodi di registrazione shap nell'occhio del moscerino. Tutti i manipolatori elencati stanno fornendo con successo registrazioni stabili di lunga durata dai fotorecettori di Drosophila e dalle LMC.
Huxley Bertram	Asse xyz Huxley con controllo manuale di precisione
Sensapex	Sensapex a triplo asse
Märzhäuser	Märzhäuser DC-3K con stepper piezoelettrico aggiuntivo sull'asse x e controller MS 314
Supporti magnetici	Qualsiasi base magnetica con interruttore on/off andrà bene		Ad esempio, per gestire i cavi all'interno della gabbia di Faraday
Portaelettrodi	Apparato di Harvard	ESP/W-F10N
Filo d'argento	Strumenti di precisione mondiali	AGW1510	Diametro 0,3 - 0,5 mm; deve essere clorurato per i portaelettrodi
Sorgente luminosa in fibra ottica	Molti diversi, tra cui Olympus
Pacchetti di fibre ottiche	Tecnologia UltraFine		Per fornire lo stimolo luminoso a LED al sistema a bracci cardanici. Utilizziamo guide di luce sia liquide che al quarzo (gamma da UV a IR)
Laboratori Thorn
Tubo di catetere per mosche		P80-50P Tubo da 50 ml Cent. PP., Confezione da 100 pz	Tagliare il fondo conico dalla provetta da centrifuga in plastica da 50 ml e incollarvi sopra un puntale per pipetta da 1 ml.
Sistema di acquisizione digitale	Strumenti nazionali
Amplificatore per microelettrodi a morsetto di corrente/tensione a elettrodo singolo	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ prodotti/amplificatori/sec-single- electrode-clamp/sec-10lx.html	Interprete eccezionale!
Stadio di testa	Standard (+/- 150 nA)	Per npi SEC-10LX
Sorgenti luminose e driver a LED	OptoLED a 2 canali (Cairn Research Ltd., Regno Unito)		Molti dei nostri sistemi di stimolo sono costruiti internamente
Auto-progettato e costruito
Software di acquisizione e analisi	Molte aziende tra cui scegliere		Biosyst; sistema basato su Matlab per lavori sperimentali e teorici nel laboratorio Juusola
Personal Computer o Mac			Assicurarsi che il PC o il Mac sia compatibile con il sistema di acquisizione dati e il software
Sistema a braccio cardanico	Auto-progettato e costruito		Fornire un posizionamento accurato x, y, z degli stimoli luminosi
Sistema di controllo della temperatura Peltier	Auto-progettato e costruito
Gabbia di Faraday	Autocostruito		Schermatura elettromagnetica dal rumore
Capillari in vetro borosilicato filamentato		Diametro esterno: 1 mm
Diametro interno: 0,5 - 0,7 mm
Capillari in vetro di quarzo filamentato		Diametro esterno: 1 mm
Diametro interno: 0,5 - 0,7 mm
Estrattore per pipette	Azienda di strumenti Sutter	Modello P-2000 laser Flaming/Brown Micropipette Puller	Per gli elettrodi di riferimento in borosilicato, utilizzare il programma preimpostato #11 (elettrodi patch): Calore = 350; Filamento = 4; Velocità 36; Ritardo = 200).1.2.1). Per gli elettrodi di registrazione in borosilicato, utilizzare il programma preimpostato #12 (che in genere estrae buoni diesis convenzionali per le registrazioni con fotorecettori): Calore = 355; Filamento = 4; Velocità 50; Ritardo = 225; Tiro = 150. Per le registrazioni LMC, che richiedono elettrodi con punte più fini, questi valori devono essere regolati. Per l'estrazione di capillari in quarzo, il manuale P-2000 suggerisce programmi per microelettrodi a punta fine. I parametri preimpostati di questi programmi servono come utili punti di partenza per modifiche sistematiche per generare elettrodi con un buon successo di penetrazione e un basso rumore di registrazione.
Soluzione Ringer Extracellulare per l'elettrodo di riferimento	Prodotti chimici di Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, saccarosio	Vedi la ricetta nella sezione protocollo
Soluzione 3 M KCl per il riempimento del microelettrodo di registrazione filamentato	Sali da Fisher Scientific	10010310, KCl
vaselina	Vaselina