Monitoraggio dei segnali elettrici dai neuroni afferenti in una larva di pesce zebra immobilizzata

Abstract

Fonte: Lunsford, E. T., et al. Attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto nel pesce zebra. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra la registrazione di segnali elettrici dai neuroni afferenti in una larva di pesce zebra paralizzata posizionando una micropipetta vicino al ganglio della linea laterale e formando un sigillo allentato per la cattura del segnale. La soluzione extracellulare mantiene la vitalità neuronale durante questo processo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione dei materiali per le registrazioni elettrofisiologiche

1. Realizza un disco di registrazione con fondo in elastomero siliconico.
   1. Erogare un sottile strato di componenti in elastomero siliconico automiscelante (ad es. Sylgard) in una piastra di coltura tissutale con fondo di vetro fino a quando non si livella con il bordo di un pozzetto poco profondo. Circa 0,5 ml sono sufficienti.
   2. Coprire e polimerizzare la pirofila per un minimo di 48 ore a temperatura ambiente.
2. Crea perni di dissezione.
   1. Utilizzando un alimentatore CC, fornire una carica negativa (5 V) a un becher da 100 mL di mordenzante (3M KOH) e collegare un filo di tungsteno (0,002 pollici; 50,8 μm di diametro) all'uscita caricata positivamente.
      cautela: I fili negativo e positivo non devono entrare in contatto tra loro durante questa procedura poiché si potrebbe correre il rischio di produrre scintille, che potrebbero rappresentare un potenziale pericolo di incendio.
   2. Mordenzare il filo di tungsteno immergendo rapidamente e ripetutamente la punta nel bagno di mordenzatura fino a quando la punta non si restringe fino a diventare una punta acuminata. Sotto uno stereomicroscopio, tagliare il filo a circa 1 mm dalla punta con una lama di rasoio a lama dritta. Ripetere altre tre volte, quindi inserire gli spilli nel piatto di registrazione polimerizzato utilizzando una pinza fine.
3. Preparare gli elettrodi di registrazione.
   1. Utilizzando un estrattore per micropipette orizzontale con filamento a scatola, tirare un tubo capillare in vetro borosilicato (diametro interno: 0,86 mm, diametro esterno: 1,50 mm) in elettrodi con una punta di 30 μm di diametro con una leggera conicità (Figura 1 Ai) che verrà utilizzato per registrare i neuroni afferenti dalla linea laterale posteriore.
   2. Inserire un tubo capillare aggiuntivo in vetro borosilicato in una coppia di elettrodi con diametro della punta più piccolo (1-5 μm). Tenendo un elettrodo in ciascuna mano, far scorrere delicatamente le punte l'una sull'altra per romperle a un angolo di ~30°. Utilizzando una microforgia, lucidare la punta smussata fino a renderla liscia.
4. Genera il protocollo nei programmi di registrazione elettrofisiologica.
   1. Assicurarsi che lo stadio di testa destro sia collegato all'ingresso del canale 1 nella parte posteriore del microelettrodo amplificatore di corrente e morsetto di tensione per le registrazioni dei neuroni afferenti.
      NOTA: Le specifiche del computer per l'amplificatore di corrente e tensione richiedono almeno un processore da 1 Ghz o superiore, Windows XP Pro o Mac OS X 10.46.6, un'unità CD-ROM con 512 MB di RAM, 500 MB di spazio su disco rigido e 2 porte USB.
   2. Aprire il software dell'amplificatore controllato dal computer.
   3. Impostare il canale 1 in modalità current-clamp facendo clic sul pulsante IC.
   4. Immettere il seguente parametro nella scheda I-Clamp 1. Uscita primaria: 100x Potenziale di membrana CA (100.000 mV/mV), Guadagno: 1.000, Bessel: 1 kHz, CA: 300 Hz, Portata: Bypass. Uscita secondaria: 100x potenziale di membrana CA (100 mV/mV), guadagno: 1, filtro passa-basso: 10 Hz.
   5. Salvare il parametro del canale come Ch1_Aff.
   6. Installare e aprire il software di elettrofisiologia patch clamp.
   7. Fare clic su Configura e selezionare Lab Bench per impostare i segnali analogici aggiungendo Ch1_Aff ai canali del digitalizzatore (ad esempio, Analog IN #0 e Analog IN #1) collegati tramite cavo coassiale BNC alle corrispondenti uscite scalate del canale 1 dell'amplificatore. Fare clic su OK.
      NOTA: I requisiti minimi del computer per il digitalizzatore sono: un processore da 1 Ghz o superiore, Windows XP Pro o Mac OS X 10.46.6, unità CD-ROM 512 MB di RAM, 500 MB di spazio su disco rigido e 2 porte USB.
   8. Fare clic su Acquisisci e selezionare Nuovo protocollo.
   9. Nella scheda Modalità/Velocità, selezionare Gap Free; in Modalità di acquisizione, impostare Durata di prova su Utilizza spazio su disco disponibile (ad esempio, registrare fino all'arresto) o una Durata impostata desiderata (hh:mm:ss), quindi impostare la Frequenza di campionamento per segnale (Hz) su 20.000 per massimizzare la risoluzione.
   10. Nella scheda Input, selezionare i canali IN analogici configurati in precedenza (al punto 1.4.6) e selezionare Ch1_Aff per il canale corrispondente.
   11. Nella scheda Output selezionare Cmd 0 e Cmd 1 rispettivamente per il canale #0 e il canale #1.
       1. Collegare il comando del canale 1 sull'amplificatore all'uscita analogica 0 sul digitalizzatore tramite cavo coassiale BNC.
   12. Le schede rimanenti possono rimanere sotto le impostazioni predefinite. Fare clic su OK e salvare il protocollo.

2. Preparazione della soluzione

1. Preparare la soluzione di Hank: 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO₄, 0,44 mM KH₂PO₄, 1,3 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO₄, 4,2 mM NaHCO₄; pH 7,3. Diluire al 10% la soluzione di Hank aggiungendo il volume appropriato di acqua deionizzata al brodo.
2. Preparare la soluzione extracellulare: 134 mM di NaCl, 2,9 mM di KCl, 1,2 mM di MgCl₂, 2,1 mM di CaCl₂, 10 mM di glucosio e 10 mM di tampone HEPES, pH 7,8 regolato con NaOH. Filtrare sottovuoto la soluzione extracellulare attraverso un filtro con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
3. Preparare α-bungarotossina: Sciogliere 1 mg di α-bungarotossina liofilizzata in 10 ml di soluzione extracellulare per produrre una diluizione dello 0,1%.
4. Preparare la soluzione per l'eutanasia: MS-222 tamponato al 50% (mg/L) di grado farmaceutico in soluzione di Hank al 10%.
   ATTENZIONE: α-bungarotossina è una potente neurotossina che paralizza i muscoli bloccando i recettori colinergici. Sono necessari guanti e si consiglia di proteggere gli occhi durante la manipolazione del paralitico.

3. Preparazione delle larve per le registrazioni elettrofisiologiche

1. Immobilizza le larve di pesce zebra.
   1. Utilizzare larve della popolazione di zebrafish allevata in laboratorio (Danio rerio; 4-7 giorni dopo la fecondazione) e conservarle in soluzione embrionale (10% soluzione di Hank) a 27 °C.
   2. Utilizzando una pipetta di trasferimento a punta larga, trasferire la larva dall'alloggiamento in una piccola capsula di Petri (35 mm) e rimuovere la maggior parte possibile della soluzione circostante.
      nota: La rimozione della soluzione embrionale impedisce la diluizione del paralitico e ne aumenta l'efficacia. L'angolo di una salvietta può essere utilizzato per rimuovere la soluzione embrionale rimanente ed è fondamentale non entrare in contatto con le larve o lasciarle esposte all'aria.
   3. Immergere le larve in 10 μL di α-bungarotossina allo 0,1% per circa 5 min.
      nota: Il tempo necessario per immobilizzare le larve varia tra le preparazioni. Una preparazione sana dipende da un attento monitoraggio del flusso sanguigno veloce e sostenuto e della diminuzione delle risposte motorie. Una breve sovraesposizione al paralitico può portare a un lento declino della salute generale del preparato, anche dopo un accurato lavaggio. È meglio applicare un lavaggio prima che la larva sia completamente immobilizzata mentre mostra ancora segni di sottili vibrazioni muscolari.
   4. Lavare la larva paralizzata con la soluzione extracellulare e fare il bagno per 10 min.
      nota: Il dilavamento consente alla larva di passare da sottili vibrazioni muscolari alla paralisi completa. Inoltre, la α-bungarotossina è un antagonista della subunità α9 del recettore nicotinico dell'acetilcolina (nAChR), che è un componente critico del circuito di feedback endogeno osservato da questo protocollo; tuttavia, è stato dimostrato che questo effetto è reversibile nelle cellule ciliate di Xenopus e zebrafish dopo un washout di 10 minuti.
2. Appuntare il pesce nel piatto di registrazione.
   nota: L'anestesia (ad es. MS-222, Tricaina) non è necessaria durante la preparazione delle larve di pesce zebra (4-7 dpf) poiché interferisce con la salute degli animali. In effetti, le larve di pesce zebra sono esenti da alcuni protocolli per i vertebrati.
   1. Utilizzando una pipetta di trasferimento, spostare la larva dal bagno di soluzione extracellulare al piatto di registrazione con fondo in silicone. Riempi il resto del piatto con la soluzione extracellulare.
   2. Sotto uno stereomicroscopio, posizionare delicatamente le larve con una pinza a punta fine sopra il centro del tappetino in silicone, con il lato laterale rivolto verso l'alto, con le estremità anteriori e posteriori del corpo che corrono rispettivamente da sinistra a destra. Quindi afferrare un perno inciso dal tappetino in silicone utilizzando una pinza a punta fine e inserire il perno, ortogonalmente al silicone, attraverso la notocorda dorsale delle larve direttamente dorsale all'ano. Inserire il secondo perno attraverso la notocorda vicino all'estremità della coda e inserire il terzo perno attraverso la dorsale della notocorda della camera d'aria del gas (Figura 1B).
      nota: Durante l'inserimento dei perni, è importante puntare al centro della larghezza della notocorda per evitare di interferire con il flusso sanguigno o danneggiare la muscolatura circostante. La notocorda è dorsale al nervo della linea laterale posteriore, quindi con un corretto pinning, non ci si aspetta alcun danno ai neuroni sensoriali della linea laterale. Inserire dopo il primo contatto in modo da non disturbare il tessuto circostante. Idealmente, il diametro del perno è inferiore alla metà della larghezza della notocorda per garantire un inserimento pulito. Se i perni superano questa larghezza, ripetere il passaggio 1.2 fino a raggiungere la larghezza del perno desiderata. Se il flusso sanguigno rallenta dopo il pinning, ripetere dal passaggio 1.3 in poi con un nuovo campione.
   3. Inserire il quarto perno attraverso la vescicola otica fornendo una leggera rotazione verso la parte anteriore mentre il perno si inserisce nell'incapsulante (Figura 1B). Quando viene applicata una leggera rotazione, osservare il tessuto tra il cleitro e la vescicola otica per rivelare il grappolo di somata afferente.
      nota: L'inserimento angolato del quarto perno serve a garantire l'esposizione del ganglio afferente della linea laterale posteriore, che altrimenti è ostruito dalla grande vescicola otica.

4. Registrazione dei neuroni afferenti

1. Riempire l'elettrodo di registrazione afferente con 30 μl di soluzione extracellulare, inserirlo nel portapipetta dello stadio di testa destro (Figura 1B, C) e abbassarlo nella soluzione di piatto applicando una pressione positiva (1-2 mm Hg) prodotta da un trasduttore pneumatico.
2. Individuare e attaccare liberamente al ganglio afferente della linea laterale posteriore.
   1. Utilizzando un micromanipolatore, abbassare la punta dell'elettrodo afferente fino a quando non si mantiene in posizione sopra il cleitro.
   2. Aumentare l'ingrandimento a 40x per l'immersione e individuare l'intersezione tra il nervo della linea laterale posteriore e il cleitro. Seguire il nervo della linea laterale anteriore dal cleitro fino al punto in cui le fibre innervano il ganglio afferente della linea laterale posteriore, distinguibile dal grappolo discreto di soma (Figura 1F).
   3. Portare la punta dell'elettrodo sopra il ganglio afferente e abbassare la pipetta fino a quando la punta non tocca l'epitelio. Manovrare delicatamente l'elettrodo in modo che l'intera circonferenza della punta entri in contatto con il ganglio afferente.
   4. Applicare una pressione negativa (20-50 mm Hg) con il trasduttore pneumatico e tenere premuto.
      nota: La pressione negativa applicata al ganglio afferente è delicata. L'aumento della pressione negativa può migliorare il rapporto segnale-rumore, ma la salute dei neuroni afferenti diminuisce in caso di aspirazione aggressiva sostenuta, il che riduce la probabilità di una registrazione di successo.
3. Registra l'attività dei neuroni afferenti.
   1. Lo stadio principale sinistro deve essere collegato all'amplificatore, che trasmette il segnale amplificato in un digitalizzatore che emette il suddetto segnale nel software di elettrofisiologia patch clamp per essere monitorato su un computer adiacente.
   2. In pClamp10, fare clic sul pulsante Riproduci sulla barra degli strumenti per monitorare i neuroni afferenti.
   3. Assicurarsi che l'intera cellula, la registrazione a chiazze libere dei neuroni afferenti sia raggiunta una volta che i picchi si verificano spontaneamente, all'incirca ogni 100-200 ms (Figura 1E).
   4. Gradualmente, aumentare la pressione dell'elettrodo di registrazione del neurone afferente a quella atmosferica (0 mm Hg) e tenerla premuta per il resto della registrazione.

Risultati

Figura 1: Registrazione elettrofisiologica simultanea dell'attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore e della radice motoria ventrale. (A). Esempio di elettrodi di registrazione afferenti (i) e radice motoria ventrale (ii) a patch sciolta. Le barre della scala rappresentano 50 μm. (B) Le larve di pesce zebra sono ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bicchiere da 100 mL	pirex	1000	Recipiente per mordenzante
10x obiettivo ad immersione in acqua	Olimpo	UMPLFLN10xW	Basso ingrandimento per il posizionamento delle larve e l'elettrodo di registrazione
40x obiettivo ad immersione in acqua	Olimpo	LUMPLFLN40XW	Ingrandimento più elevato per la posizione della punta dell'elettrodo e per la definizione del patch-clamp
Cavi coassiali BNC	ThorLabs	2249-C-12	Collegamento dei canali dell'amplificatore e del digitalizzatore; richiede 4
Capillari in vetro borosilicato con filamento	Strumenti Warner	G150F-3	Diametro interno: 0,86, diametro esterno: 1,50; vetro capillare utilizzato per formare elettrodi di registrazione
computer	N/A	N/A	Qualsiasi computer dovrebbe funzionare
Alimentazione CC	Tenma	72-420	Utilizzato per l'incisione elettrica di perni di dissezione
Digitalizzatore di elettrofisiologia	Strumenti per assoni, dispositivi molecolari	Axon DigiData 1440A	Consente l'acquisizione dei dati di patch-clamp
filamento	Azienda di strumenti Sutter	FB255B	Filamento da 2,5 mm utilizzato nell'estrattore per micropipette
Pinze fini	Strumenti per la scienza	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) N. articolo 11295-10	Utilizzato per manipolare le larve e inserire i perni
Microscopio DIC a tavolino fisso	Olimpo	BX51WI	Microscopio utilizzato per visualizzare e stabilire registrazioni patch-clamp
Puntale per pipetta flessibile e conico	Fisher Scientifico	02-707-169	Le punte flessibili consentono l'inserimento nell'elettrodo di registrazione per erogare la soluzione extracellulare sulla punta
Piatto Fluoro	Strumenti di precisione mondiali Inc.	FD3510-100	Coperchio piatto di registrazione con fondo in vetro
Salvietta KimWipe	KimTech	Telefono 34155	Salvietta da lavoro utilizzata per eliminare il liquido in eccesso dalle larve
Kwik-Gard	Strumenti di precisione mondiali Inc.	710172	Elastomero automiscelante sylgard
Amplificatore a microelettrodi	Strumenti per assoni, dispositivi molecolari	MultiClamp 700B	Amplificatore patch clamp per registrazioni a doppio canale
Microforgia	Narishige	MF-830 microforgiatura	Per lucidare l'elettrodo di registrazione
Unità di controllo per micromanipolatore	Siskiyou	MC1000-eR/T	Coordinatore a quadrante a 4 assi per il controllo del micromanipolatore
Estrattore per micropipette	Azienda di strumenti Sutter	Fiammeggiante/Marrone P-97	Per l'estrazione del vetro capillare negli elettrodi di registrazione
Unità di controllo per microscopio	Siskiyou	MC1000e	Posiziona il microscopio attorno al tavolino fisso e alla preparazione
Micromanipolatore a motore	Siskiyou	MX7600	Posiziona l'headstage e l'elettrodo di registrazione collegato per la registrazione patch-clamp
MultiClamp Commander	Dispositivi molecolari	2.2.2	Scaricabile dalla pagina di download di Axon MultiClamp 700B Commander
Tavolo ottico ad aria	Società di Newport	VH3036W-OPT	Tavolo di isolamento breadboard per galleggiare al microscopio e ridurre al minimo le vibrazioni durante le registrazioni
pCLAMP	Dispositivi molecolari	10.7.0	Scaricabile dal software di acquisizione e analisi dei dati per elettrofisiologia Axon pCLAMP 10 Pagina di download
Capsula di Petri	Falcone	35-3001	Utilizzato per immergere le larve in paralisi
Porta pipette	Dispositivi molecolari	1-HL-U	Tenere premuto l'elettrodo di registrazione e collegarlo all'headstage
Trasduttore pneumatico	Strumenti Fluke Biomedical	DPM1B	Per il controllo della pressione interna dell'elettrodo di registrazione
idrossido di potassio	Sigma-Aldrich	Codice 221473-25G	Mordenzante per incisione di perni di dissezione
Tubi in silicone	Tygon	14-169-1A	Tubo per collegare il trasduttore pneumatico al portapipetta
Stereomicroscopio	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	Utilizzato per visualizzare le punte degli spilli e durante la preparazione delle larve
Lama di rasoio a lama dritta	Canopus	Ordina da amazon.com	Taglia il filo di tungsteno mentre realizza i perni di dissezione
siringa	Azienda Becton Dickinson	309602	Riempito con soluzione extracellulare da iniettare negli elettrodi di registrazione
Pipetta di trasferimento	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	Pipetta monouso, non sterile, per il trasferimento di larve
Tricaina metansolfonato	Syndel	Codice: 12854	Anestetico farmaceutico utilizzato per l'eutanasia delle larve ad alto dosaggio.
Filo di tungsteno	Strumenti di precisione mondiali Inc.	Codice: 715500	0,002 pollici, diametro 50,8 μm; utilizzato per realizzare perni di dissezione
Unità di filtrazione sottovuoto	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	Unità di filtrazione monouso, sterili, sottovuoto utilizzate per sterilizzare la soluzione extracellulare utilizzata per elettrodi ringer per elettrofisiologia
Stadio di testa con pinza di tensione	Dispositivi molecolari	CV-7B	Fornito con amplificatore MultiClamp 700B utilizzato come headstage sinistro e destro
α-bungarotossina	ThermoFisher	B1601	Per immobilizzare le larve prima della registrazione