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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione di Fette di Cervello Ippocampale Acuto
- Preparazione delle soluzioni di fetta
- Preparare 500 mL di soluzione di taglio del saccarosio composta da: 194 mM di saccarosio, 30 mM di NaCl, 4,5 mM di KCl, 10 mM di D-glucosio, 1 mM di MgCl2, 1,2 mM di NaH2PO4 e 26 mM di NaHCO3, 290-300 mOsm, saturi con il 95% di O2 e il 5% di CO2.
- Preparare 1-2 litri di soluzione di registrazione (liquido cerebrospinale artificiale, ACSF) composta da: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glucosio, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4 e 26 mM NaHCO3; pH 7,3 - 7,4 (dopo gorgogliamento), 290 - 300 mOsm, saturo con il 95% di O2 e il 5% di CO2. Riempire con la soluzione di registrazione un becher contenente una camera porta fette di cervello e mantenerla a 32-34 °C. Riempire la camera del vibratomo con granita ghiacciata.
- Preparazione acuta della fetta
- Anestetizzare profondamente un topo mettendolo in una campana di vetro precaricata con 2-3 ml di isoflurano. Controlla il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi e, se non risponde, decapitalo rapidamente usando un paio di cesoie affilate o ghigliottina come richiesto dal tuo protocollo animale.
- Praticare un'incisione di 2-3 cm utilizzando le cesoie dalla parte caudale del cranio per tagliare il cuoio capelluto lungo la linea mediana. Mentre si ritrae manualmente il cuoio capelluto, praticare due incisioni orizzontali di 1 cm dal forame magno lungo i lati del cranio. Quindi, usando delle cesoie sottili, incidi un'incisione lunga il cranio, lungo la linea mediana dalla parte posteriore del cranio al naso.
- Utilizzando una pinza sottile inserita vicino alla linea mediana, ritrarre il cranio inciso in due porzioni. Estrarre il cervello del topo dal cranio e utilizzare una lama per rimuovere il cervelletto e i bulbi olfattivi, che si trovano rispettivamente nella parte caudale e rostrale del cervello. Questi possono essere identificati dalle grandi fessure, che li separano dalla corteccia.
- Monta il blocco cerebrale sul vassoio del vibratomo usando la super colla. Riempi la vaschetta del vibratomo con una soluzione di taglio ghiacciata.
- Tagliare sezioni di tessuto sul piano coronale a uno spessore di 300 μm. Di solito, è possibile raccogliere 6 fette di ippocampo coronale.
- Dopo che ogni sezione è stata tagliata, trasferire immediatamente le fette nel bicchiere porta fette riscaldato a 32-34°C. Mantenere le sezioni a questa temperatura per 20 minuti prima di rimuovere il bicchiere contenente le sezioni e posizionarlo a temperatura ambiente per almeno 20-30 minuti prima della registrazione.
2. Misurazione della dinamica del K+ evocata elettricamente
- Impostazione della preparazione della fetta
- Posizionare delicatamente la fetta di cervello nella vasca da bagno utilizzando una pipetta Pasteur e tenerla delicatamente in posizione con un'arpa di platino con corde di nylon.
- Assicurarsi che le punte dell'elettrodo stimolante bipolare siano parallele tra loro e siano a livello del piano della fetta. Lentamente, nel corso di 6-7 secondi, inserire gli elettrodi nello strato radiante CA3 a circa 40-50 μm di profondità per stimolare i collaterali di Schaffer. Nelle sezioni coronali, CA3 può essere approssimativamente identificato come la porzione dell'ippocampo proprio lateralmente allo strato di cellule granulari al genere ippocampale, con lo strato radiato che cade medialmente e ventrale allo strato di cellule piramidali.
- Inserire con cautela l'elettrodo K+-selettivo nel radiato dello strato CA1 a circa 50 μm di profondità, abbassando lentamente l'elettrodo per circa 3-4 secondi. Lasciare che il potenziale si stabilizzi attraverso l'elettrodo prima di applicare le stimolazioni alla fetta: questo di solito richiede dai 5 ai 10 minuti. Se la fetta mostra cambiamenti spontanei nel K+ extracellulare, scartare e ripetere questo processo con una nuova fetta.
- Misura il rilascio di K+ evocato
- Applicare treni di stimolazione elettrica (8 impulsi) premendo manualmente il grilletto sullo stimolatore mentre si registrano digitalmente le risposte. Applicare la stimolazione a 10 Hz e 1 ms di larghezza dell'impulso, a partire da un'ampiezza dello stimolo di 10 μA.
- Applicare ampiezze di stimolazione crescenti di un fattore 2 fino a quando non viene rilevata un'ampiezza massima di risposta K+. Se non si nota alcuna risposta, avvicinare la posizione dell'elettrodo K+ al sito di stimolazione di 100 μm con incrementi
- Determina l'ampiezza dello stimolo che produce la risposta semimassimale. Nella nostra esperienza, questo è compreso tra 40 e 160 μA, a seconda della qualità della preparazione, dell'età dell'animale e della distanza tra gli elettrodi di stimolazione e l'elettrodo selettivo K+.
- Nella stessa fetta, utilizzando un'ampiezza di stimolo di un passo inferiore all'ampiezza che produce la risposta semimassimale (ad esempio, se 80 μA producono una risposta semimassimale, utilizzare 40 μA) si applicano treni di stimolo con un numero crescente di impulsi. Inizialmente, abbiamo utilizzato treni da 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128 impulsi.
- Per confermare che i segnali K+ sono mediati dall'attivazione del potenziale d'azione del bagno collaterale di Schaffer stimolato elettricamente, applicare 0,5 μM di tetrodotossina (TTX) in ACSF per 10 minuti e ripetere il protocollo di stimolazione. Non si devono osservare risposte evocate.
- Dopo aver terminato l'esperimento con la fetta, confermare che l'elettrodo ha mantenuto la sua reattività ricalibrando l'elettrodo nelle soluzioni di calibrazione e assicurandosi che la risposta non si sia discostata di oltre il 10% dalla calibrazione iniziale