$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
NOTA: Le registrazioni da Q175 wild-type (WT) ed eterozigoti (HET) possono essere eseguite a qualsiasi età e sesso. Qui abbiamo studiato maschi e femmine di età compresa tra 51 e 76 settimane.
1. Iniezione del sensore di glutammato iGluu per l'espressione negli assoni corticostriatali
- Utilizzare l'estrattore per pipette (modalità in un solo passaggio) per preparare pipette in vetro borosilicato per l'iniezione del virus. Dopo l'estrazione, rompere manualmente la pipetta per ottenere un diametro del puntale di 30-50 μm. Autoclavare la pipetta e gli strumenti chirurgici, compreso il trapano per l'apertura del cranio.
- Conservare il virus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 10,13gc/mL) a -80 °C in aliquote da 10 μL. Se le iniezioni vengono eseguite poco dopo la produzione del virus (entro 6 mesi), mantenere a 5 °C. Prima dell'intervento chirurgico, estrarre la fiala e mantenerla a temperatura ambiente.
- Riempi la pipetta di vetro e rimuovi eventuali bolle.
- Anestetizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di una soluzione contenente 87,5 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilazina. Iniettare per via sottocutanea lo 0,25% di bupivacaina (8 mg/kg) per un ulteriore sollievo dal dolore. Controllare la profondità dell'anestesia monitorando il tono muscolare e osservando l'assenza di riflessi indotti dal dolore.
- Radere la pelle della testa e sterilizzarla con alcool al 70%. Inserire il mouse nel fotogramma stereotassico.
- Utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle e un trapano ad alta velocità (38.000 giri/min) per praticare un foro di 1,2 mm nell'osso sopra la corteccia motoria.
- Montare la siringa con la pipetta per iniezione collegata nel supporto di un manipolatore di precisione. Inserire la pipetta orientata verticalmente nella corteccia in 4 siti diversi. Le coordinate di iniezione sono, rispetto alla bregma (in mm): anteriore 1,5, laterale 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. La profondità rispetto alla dura madre è (in mm): 1,5–1,7.
- Utilizzando il sistema di iniezione, iniettare 0,3 μl per sito della soluzione virale non diluita con una velocità di 0,05 μl/min. Dopo ogni iniezione, lasciare la pipetta in posizione per 1 minuto prima di estrarla lentamente (1 mm/min).
- Terminare chiudendo la ferita chirurgica con una sutura di nylon.
- Lasciare il mouse per 0,5-1 ora su un termoforo in una gabbia pulita prima di rimetterlo nella sua gabbia originale.
- Mantenere il topo su un ciclo giorno-notte di 12 ore per 6-8 settimane prima della preparazione di fette cerebrali acute.
nota: Per evitare reazioni immunitarie con conseguente danno cellulare e perdita di sinapsi, l'iniezione di più costrutti virali deve essere eseguita contemporaneamente o entro 2-3 ore dall'iniezione primaria. Le coordinate per l'iniezione di iGluu sono state selezionate in base all'atlante cerebrale di Paxinos e Franklin. Corrispondono alla corteccia motoria M1. L'immunocolorazione del cervello iniettato ha permesso di visualizzare numerosi assoni e varicosità assoniche nell'ipsi e nello striato controlaterale e nelle cortecce M1 e S1 controlaterali.
2. Cerca i terminali glutammatergici che esprimono il sensore di glutammato iGluu
- Modalità di calibrazione
- Preparare la fotocamera sCMOS e il software di controllo della fotocamera con le seguenti impostazioni. Nella pagina Lettura impostare Frequenza di lettura dei pixel: 560 MHz (= lettura più veloce), Sensibilità/Gamma dinamica: bit, Filtro rumore spurio: Sì, Lettura sovrapposta: Sì. Nella pagina Binning/ROI, seleziona Schermo intero.
- Preparare un vetrino contenente una goccia di 5 mg/mL di Lucifer Yellow (LY) sotto un vetrino coprioggetto.
- Posizionare la diapositiva LY sotto un obiettivo 63x, aprire l'otturatore laser ed eseguire un'acquisizione seriale utilizzando le seguenti impostazioni: Pixel Binning: 1x1, Modalità trigger: Interno, Tempo di esposizione: Minimo (da determinare).
- Regolare la potenza del laser per produrre uno spot di fluorescenza di 4 μm di diametro (l'immagine non deve contenere pixel saturi).
- Per eseguire una calibrazione del sistema di posizionamento laser, selezionare le seguenti impostazioni nel software di posizionamento laser: Diametro dello spot: 10, Velocità di scansione: 43.200 kHz. Fare clic sul pulsante Avvia acquisizione immagine nel pannello di destra. Impostare Esecuzioni: 0, Ritardo esecuzione: 0 e selezionare l'opzione Esegui a TTL nella pagina Sequenza. Fare clic sul pulsante Calibra nella pagina Calibrazione e calibrare il software di controllo laser secondo le istruzioni mostrate nell'angolo in alto a sinistra della schermata di acquisizione.
- Se la configurazione utilizza un software indipendente per il controllo della fotocamera e del laser, acquisire gli screenshot dalla finestra di acquisizione della fotocamera e inviarli al software di controllo laser per un ricalcolo delle coordinate XY. Se il software è installato su computer diversi, utilizzare un video grabber per importare l'immagine nel software di controllo laser. Il software di controllo laser avrà bisogno delle informazioni sui fattori di scala XY e sugli offset. A tale scopo, determinare le coordinate degli angoli in alto a sinistra, in basso a sinistra e in basso a destra dell'immagine all'interno della finestra di acquisizione del programma di controllo laser. Calcola i fattori di scala secondo le seguenti equazioni: Fattore X = (X in basso a destra – X in basso a sinistra)/2048, Offset X = X in basso a sinistra, Fattore Y = (Y in alto a sinistra – Y in basso a sinistra)/2048, Y offset = Y in basso a sinistra.
- Al termine della procedura di calibrazione, creare una regione di interesse (ROI) rettangolare di 267x460 pixel, spostarla al centro dello schermo e fare clic sul pulsante Avvia sequenza.
- Tornare alle seguenti impostazioni del software di controllo della fotocamera: Binning: 2x2, Modalità trigger: Esposizione esterna, Tempo di esposizione: Minimo (da determinare).
- Modalità di correzione dell'autofluorescenza
NOTA: Il livello di riposo di [Glu] nell'ambiente dei terminali sinaptici attivi è tipicamente inferiore a 100 nM. Di conseguenza, qualsiasi sensore di glutammato, in particolare un sensore a bassa affinità come iGluu, sarà piuttosto debole in assenza di rilascio sinaptico di glutammato. Tuttavia, una certa fluorescenza di iGluu può essere rilevata anche a riposo, ma deve essere distinta dall'autofluorescenza tissutale. L'illuminazione a 473 nm suscita sia la fluorescenza iGluu che l'autofluorescenza (Figura 1A-C). Quest'ultimo occupa un'ampia gamma di lunghezze d'onda, mentre la fluorescenza di iGluu è limitata a 480-580 nm (con un massimo a 510 nm). La correzione per l'autofluorescenza si basa sull'acquisizione di due immagini con diversi filtri passa-alto.
- Prepara le fette di cervello in anticipo come descritto altrove. Tenete pronte le fette di crusca.
- Trasferire le fette nella camera di registrazione, immergendole nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (ACSF) contenente 125 mM di cloruro di sodio (NaCl), 3 mM di cloruro di potassio (KCl), 1,25 mM di idrogeno sodio fosfato (NaH2PO4), 25 mM di bicarbonato di sodio (NaHCO3), 2 mM di cloruro di calcio (CaCl2), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl2), 10 mM di glucosio (pH 7,3, 303 mOsm/L), integrati con 0,5 mM di piruvato di sodio, 2,8 mM di ascorbato di sodio e 0,005 mM di glutatione. Utilizzare una velocità di flusso di 1-2 ml/min. Mantenere la temperatura del bagno a 28-30 °C.
- Localizzare lo striato dorsale sotto un obiettivo a immersione in acqua 20x. Fissare le fette con una griglia di nylon su un'arpa di platino per ridurre al minimo il movimento del tessuto. Passa all'obiettivo a immersione in acqua 63x /NA 1.0. Selezionare i filtri che riflettono la luce a 473 nm (specchio dicroico) e la luce passante con lunghezze d'onda >510 nm (filtro di emissione).
- Sincronizza l'illuminazione, la stimolazione e l'acquisizione delle immagini utilizzando una scheda analogico-digitale (AD)/digitale-analogico (DA) (AD/DA) con il rispettivo software di controllo. Impostare il programma di trigger per controllare l'acquisizione con un tempo di esposizione laser di 180 ms e un tempo di acquisizione dell'immagine di 160 ms. Utilizzare il dispositivo di posizionamento laser per inviare il raggio laser a un numero predeterminato di punti e definire le impostazioni per la velocità di scansione e la dimensione dello spot.
- Acquisire un'immagine sia dell'autofluorescenza che delle struttureu-positive iGlu utilizzando un filtro passa-alto a 510 nm ("immagine gialla").
- Acquisire un'immagine con la sola autofluorescenza utilizzando un filtro passa-alto a 600 nm ("immagine rossa").
- Ridimensiona le immagini rosse e gialle, utilizzando le intensità medie dei 10 pixel più luminosi e dei 10 pixel più scuri per definire l'intervallo. Eseguire una sottrazione "immagine gialla meno rossa" e ridimensionare l'immagine sottratta per generare un file tif standard a 8 bit per una comoda visualizzazione del pulsante di interesse (Figura 1D). Contiene i pixel luminosi delle struttureu-positive iGlu, i pixel grigi dello sfondo e i pixel scuri delle strutture con autofluorescenza.
nota: Con l'apparecchiatura data la fluorescenza media a riposo (F) sarà inferiore a 700 U.A.
- Modalità di ricerca Bouton
NOTA: I pixelu-positivi di iGlu possono appartenere a elementi funzionalmente diversi dell'albero assonale, come rami assonali di diverso ordine, siti di biforcazione, varicosità dopo l'esaurimento delle vescicole o varicosità completamente attive. Tuttavia, è quasi impossibile identificare i terminali sinaptici funzionali solo con un'ispezione visiva. Pertanto, ogni terminale sinaptico glutammatergico necessita di identificazione in base alla sua reattività alla depolarizzazione elettrica. I siti che non rispondono alla stimolazione devono essere scartati. Il mezzo fisiologico per indurre il rilascio di glutammato dagli assoni corticostriatali è quello di suscitare un potenziale d'azione. Ciò può essere ottenuto utilizzando un canale rodopsina di appropriate caratteristiche spettrali o mediante stimolazione elettrica di un assone visualizzato da iGluu stesso. Per evitare l'attivazione accidentale dell'opsina, abbiamo preferito quest'ultimo approccio
- Utilizzare l'estrattore per micropipette (in modalità a quattro fasi) per produrre pipette di stimolazione da capillari in vetro borosilicato. Il diametro interno della punta dovrebbe essere di circa 1 μm. Quando riempito con ACSF, la resistenza dell'elettrodo deve essere di circa 10 MΩ.
- Per indurre il rilascio di glutammato dipendente dal potenziale d'azione da una serie di bottoni sinaptici attaccati allo stesso assone, utilizzare l'ingrandimento 63x, il filtro di emissione a 510 nm e l'immagine sottratta per posizionare un elettrodo di stimolazione in vetro accanto a una varice fluorescente. Evitare la vicinanza di assoni aggiuntivi.
- Accendere lo stimolatore per erogare impulsi di corrente depolarizzante alla pipetta di stimolazione. Utilizzare intensità di corrente intorno a 2 μA (non più di 10 μA).
- Accendere il sistema di applicazione del bagno multicanale in cui un canale eroga la soluzione standard per il bagno e gli altri canali forniscono i bloccanti necessari dei canali ionici, dei trasportatori o dei recettori a membrana. Controllare il flusso nel sito di registrazione e quindi passare al canale della tetrodotossina (TTX) (soluzione per il bagno più 1 μM di TTX). Dopo 2-3 minuti, stimolare nuovamente il pulsante di interesse, ma questa volta in assenza di generazione di potenziale d'azione. Il rilascio è direttamente dovuto all'afflusso di calcio attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti.
- Ruotando il tasto dell'intensità sullo stimolatore, regolare la corrente di stimolazione per ottenere risposte simili a quelle suscitate dai potenziali d'azione. Tipicamente, la corrente di stimolazione sarebbe di circa 6 μA per una depolarizzazione di 0,5 ms.
- Per l'analisi di base del preparato, applicare 0,5 mM di CdCl2. La presenza di questo rilascio di glutammato bloccante dei canali del calcio impedisce completamente il rilascio sinaptico di glutammato, convalidando così la dipendenza dal calcio del segnale del glutammato evocato direttamente.
nota: La seguente raccomandazione generale può aiutare ad aumentare il tasso di successo degli esperimenti con singole sinapsi nello striato. Per selezionare terminali sinaptici glutammatergici con un meccanismo di rilascio intatto, una varicosità dovrebbe: (i) Avere una forma liscia simile a un fuso; (ii) Non essere associato a una biforcazione dell'assone; (iii) Essere più luminoso di altre strutture sull'"immagine gialla"; (iv) Risiedono nel neuropilo striatale piuttosto che nei tratti di fibre; (v) Risiedono su un ramo assonale molto sottile; (vi) Non risiedere nelle parti più profonde della fetta.
3. Visualizzazione del rilascio e della clearance del glutammato
- Modalità di registrazione
NOTA: Dopo la sottrazione dell'autofluorescenza (passaggio 2.2) e alcuni test iniziali per la reattività del bottone di interesse (passaggio 2.3), può iniziare l'acquisizione dei dati. Le risposte all'attivazione elettrica del rilascio di glutammato dai terminali dei singoli assoni possono essere osservate direttamente nell'immagine (Figura 2), senza applicare ulteriori strumenti di analisi. Tuttavia, si è rivelato molto conveniente estrarre immediatamente alcuni indicatori di base delle prestazioni delle sinapsi (Figura 3). Queste informazioni sono necessarie per prendere decisioni sul successivo corso dell'esperimento, come la selezione di particolari tipi terminali, la valutazione rapida delle alterazioni correlate alla MH, il numero e la frequenza delle prove o dei farmaci da applicare con il sistema di superfusione. Potrebbe anche essere necessario occuparsi di artefatti che alla fine appaiono. Innanzitutto, vengono descritte le impostazioni standard per la registrazione dei dati.
- Utilizzando gli azionamenti XY del microscopio, posizionare il bottoneu-positivo iGlu testato vicino al centro del campo visivo. Interrompere l'acquisizione dell'immagine con il pulsante Interrompi acquisizione. Sull'ultima immagine acquisita, determinare la posizione XY del centro del pulsante a riposo facendo clic su di essa con il tasto sinistro del mouse. Le coordinate XY del cursore impostato verranno visualizzate nel pannello di stato inferiore della finestra di acquisizione.
- Utilizzando i dati di calibrazione (passaggio 2.1.6), calcolare le coordinate del sito in cui il raggio laser deve essere inviato per l'eccitazione della fluorescenza iGluu. Utilizzare le seguenti equazioni: Laser X = Fotocamera X * Fattore X + Offset X, Laser Y = Offset Y – Telecamera Y * Fattore Y. Durante l'esecuzione di questo ricalcolo, prestare attenzione alle impostazioni di capovolgimento verticale o orizzontale della fotocamera.
- Crea una sequenza di un punto nel software di controllo laser utilizzando le coordinate calcolate. A tale scopo, selezionare Punto nella casella Aggiungi alla sequenza nella pagina Sequenza del software di controllo laser. Selezionare 10 μs per il ritardo all'insorgenza dell'innesco e 180 ms per il tempo dell'impulso laser. Sposta il mouse sulle coordinate calcolate e fai clic con il pulsante sinistro.
- Selezionare le seguenti impostazioni nel software di controllo laser: Esecuzione: 0, Ritardo di esecuzione: 0, Sequenza: Esecuzione a TTL. Quindi fare clic su Avvia sequenza.
- Nel software di controllo della telecamera, selezionare le seguenti impostazioni: Nella pagina Binning/ROI, impostare Area immagine: Personalizzato, Pixel Binning: 2x2, Altezza: 20, Larghezza: 20, Sinistra: coordinata X del puntou-positivo iGlu a riposo meno 10 px, In basso: coordinata Y del puntou-positivo iGlu a riposo meno 10 px, Modalità di acquisizione: Serie cinetica, Lunghezza della serie cinetica: 400, tempo di esposizione: 0,0003744 s (valore minimo). Con tali impostazioni, la velocità di acquisizione sarà di 2,48 kHz.
- Seleziona la modalità di attivazione: Esterna. Fare clic su Prendi segnale nel software di controllo della telecamera. Avviare il protocollo sperimentale stabilito per il dispositivo di attivazione.
- Implementare il protocollo sperimentale Trial con la seguente linea temporale: 0 ms – inizio prova, 1 ms – inizio illuminazione laser, 20 ms – inizio acquisizione immagini con telecamera, 70 ms – inizio elettrostimolazione 1, 120 – inizio elettrostimolazione 2, 181 ms – fine trial (laser e telecamera spenti). Pertanto, durante una prova, la fotocamera acquisisce 400 fotogrammi con una frequenza di 2,48 kHz. Vedere i passaggi 2.3.3 e 2.3.5. per i dettagli sulla stimolazione elettrica.
- Per consentire un recupero sufficiente dei pool di vescicole presinaptiche, applicare il protocollo Trial con una frequenza di ripetizione di 0,1 Hz o inferiore.
- Costruzione off-line del transitorio del glutammato e valutazione rapida del rilascio e della clearance del glutammato per l'identificazione di sinapsi patologiche
- Attiva le routine di valutazione. Qui, utilizziamo un software scritto internamente SynBout v. 3.2. (autore: Anton Dvorzhak). I seguenti passaggi sono necessari per costruire un transiente ΔF/F dai pixel con elevata fluorescenza iGluu, come nel video della Figura 2.
- Per determinare la dimensione del bottone, calcolare la media e la deviazione standard (SD) dell'intensità di fluorescenza ROI a riposo (F), prima dell'inizio della stimolazione. Determinare e inscatolare l'area occupata dai pixel con F>media + 3 SD (Figura 3A). Determinare un diametro virtuale (in μm) assumendo una forma circolare dell'area soprasoglia.
- Determinare ΔF come differenza tra il valore dell'intensità di picco e F. Tracciare la corrente stimolante e ΔF/F rispetto al tempo (Figura 3B). Calcolare la SD di ΔF/F a riposo (prima dell'inizio della stimolazione) e l'"Ampiezza di picco". Utilizzare pixel con ampiezza di picco superiore a 3 SD di ΔF/F per eseguire l'adattamento monoesponenziale per il decadimento dal picco. Determinare la costante di tempo del decadimento TauD di ΔF/F.
- Per stimare l'"Ampiezza massima" in una data sinapsi, selezionare il pixel con il valore ΔF/F più alto. In genere si trova all'interno o vicino ai confini della fluorescenza del bottone a riposo iGluu. L'"ampiezza massima" sarebbe il miglior indicatore del carico di glutammato presentato al macchinario di clearance di una singola sinapsi.
