Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Chirurgia
- Per le registrazioni elettrofisiologiche, utilizzare l'uretano (ATTENZIONE) per l'anestesia.
cautela: L'uretano è tossico e cancerogeno, quindi attenersi sempre alle norme di sicurezza e alla scheda tecnica fornita dal produttore della sostanza.
- Preparare una soluzione di uretano 200 mg/mL in soluzione salina medica di cloruro di sodio (NaCl) allo 0,9%.
- Somministrare un totale di 1,3 g/kg di uretano corporeo per via intraperitoneale (IP). A seconda del ceppo di ratto, potrebbe essere ragionevole dividere la dose in due dosi con un intervallo di 15 minuti tra le iniezioni al fine di migliorare la sicurezza dell'anestesia.
- Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso di ritiro del pedale e altri riflessi adatti. Se l'anestesia non è abbastanza profonda per eseguire l'intervento chirurgico, iniettare 0,15 g/kg di peso corporeo di uretano IP e attendere altri 15 minuti.
- Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la disidratazione corneale.
- Monitorare costantemente la frequenza respiratoria e il riflesso di ritiro del pedale durante l'anestesia. Utilizzare un termoforo per animali di piccola taglia con controllo della temperatura per garantire il mantenimento di una temperatura corporea fisiologica durante l'intervento. Prima di iniziare le registrazioni elettrofisiologiche, passare a un'alternativa non elettrica (ad es. cuscinetto della testina in acetato di sodio).
- Radere il pelo lungo il lato dorsale della testa per ottenere un campo chirurgico pulito. Disinfettare intorno al sito di incisione con un disinfettante chirurgico appropriato. Fissa l'animale nel fotogramma stereotassico.
- Eseguire un'incisione lunga 2 cm del cuoio capelluto in direzione sagittale con un bisturi. Usa un bisturi per raschiare leggermente l'aponeurosi del cranio e disinfettare il cranio. Utilizzare cotton fioc imbevuti di perossido di idrogeno al 3% (H2O2) per rimuovere il tessuto residuo.
- Utilizzare un elettrocautore o un termocautario per controllare l'emorragia, se necessario. Fermare le emorragie dall'osso del cranio e dall'ipoderma, se l'emorragia non si ferma spontaneamente dopo 1-2 minuti e ostacola la vista sul cranio.
- Regolare la barra incisiva fino a quando la testa non è posizionata in posizione piatta del cranio, il che significa che il bregma e il lambda come punti di riferimento stereotassici sono sullo stesso piano. Questo è molto importante per ottenere un'elevata precisione chirurgica. Utilizzare uno strumento standard di allineamento stereotassico del ratto, calibrare la punta designata per il bregma sotto visione microscopica e regolare la barra incisiva fino a quando i punti designati per il bregma e il lambda sullo strumento toccano contemporaneamente il cranio.
nota: Una vista da un lato con luce focalizzata dall'altro può aiutare a determinare questa condizione. In alternativa, prendere un supporto stereotassico con una cannula sottile e misurare le coordinate dorsoventrali di Bregma e lambda sotto visione microscopica. Regolare la barra incisiva fino a quando le coordinate dorsoventrali di Bregma e lambda sono le stesse.
- Utilizzare un supporto stereotassico con una cannula, calibrare sulla bregma e quindi calcolare la posizione di tutti i fori sul cranio. Utilizzando il supporto stereotassico, segnare le posizioni dei fori da praticare graffiando accuratamente il cranio o utilizzando un pennarello chirurgico a colori. Le coordinate per questo dipendono dagli obiettivi; le coordinate con riferimento al bregma sono fornite per la via iperdiretta nella Tabella 1, comprese le coordinate suggerite per gli elettrodi di riferimento cerebellari.
- Utilizzando un micro trapano, praticare con cura tutti i fori. Per il nucleo subtalamico (STN) e la substantia nigra pars reticulate (SNr), praticare un foro comune (di circa 2 mm x 3 mm). Tutti gli altri fori devono avere un diametro di circa 1 mm.
- Prendi due cannule sottili (almeno 27 G) e piega le loro punte per formare una forma uncinata, usando una superficie dura o una pinzetta. Utilizzarli per rimuovere eventuali detriti dai fori e tagliare e rimuovere con cura la dura madre nel foro STN/SNr comune.
- Sciacquare i fori con soluzione fisiologica. Applicare una goccia di soluzione fisiologica ogni 15 minuti sui fori per evitare che il cervello e la dura si secchino.
- Prendi un microtrapano e una microvite in acciaio inossidabile abbinata (ad es. una vite M 1,2 mm x 2 mm), pratica un foro e avvita una microvite tra i fori degli elettrodi epidurali di riferimento sopra il cervelletto, fai lo stesso per gli elettrodi epidurali M1.
- Far scorrere gli elettrodi epidurali Ag/AgCl autocostruiti nei fori per gli elettrodi di riferimento e gli elettrodi M1. Guidare la punta dell'elettrodo con una pinzetta sottile e farla scorrere direttamente sotto l'osso del cranio nel foro.
- Fissare tutti gli elettrodi epidurali con acrilico dentale bicomponente. Assicurarsi di non coprire il punto di bregma né di intaccare il comune foro STN/SNr.
- Inserire il supporto preparato con gli elettrodi a microfilo di tungsteno nel telaio stereotassico.
- Calibrare l'elettrodo più ventrale, che ha lo scopo di indirizzare l'STN, al bregma. Regolare la posizione calcolata sopra il foro STN/SNr comune e abbassare gli elettrodi fino al cervello sotto visione microscopica. Assicurati che gli elettrodi a microfilo di tungsteno entrino senza intoppi nel cervello.
2. Mappatura e registrazioni elettrofisiologiche
NOTA: Per questo passaggio, è necessaria una gabbia di Faraday e un sistema di registrazione elettrofisiologica multicanale con software di registrazione in grado di filtrare e ordinare gli spike online. Utilizzare preferibilmente un sistema che funzioni con un preamplificatore posizionato vicino alla testa degli animali per mantenere il rumore elettrico e gli artefatti al minimo assoluto. Oltre agli elettrodi a microfilo di tungsteno, sono necessari almeno un elettrodo epidurale e uno di riferimento per eseguire le registrazioni del percorso iperdiretto. Si consiglia di inserire gli elettrodi epidurali e di riferimento a coppie senza che si tocchino, questo aiuta in caso di malfunzionamento e consente diversi tipi di riferimento nell'analisi dei dati.
- Metti una gabbia di Faraday mobile sopra il telaio stereotassico. Se è disponibile solo una gabbia di Faraday fissa, spostare con cautela il telaio stereotassico nella gabbia di Faraday, assicurandosi che gli elettrodi cerebrali profondi non vengano abbassati nel cervello fino a quando il telaio stereotassico non è nella sua posizione finale.
- Collegare gli elettrodi all'headstage della configurazione elettrofisiologica. Assicurarsi che gli elettrodi di riferimento siano collegati ai canali di riferimento appropriati.
- Configura il software di registrazione: filtro passa-banda (0,05-8.000 Hz) e amplifica (guadagno 1.500-2.000x) il segnale di dati grezzi. Utilizzare un filtro LFP e spike online con le impostazioni appropriate (filtro passa-banda 0,05-250 Hz per LFP, filtro passa-banda 300-8.000 Hz per MUA). Per tutti i filtri, utilizzare un filtro di tipo butterworth.
- Imposta una soglia di picco, se applicabile, per l'ordinamento dei picchi online. La maggior parte dei software di registrazione consente l'impostazione di una soglia di picco, che è un valore di ampiezza al di sopra del quale un segnale viene contrassegnato come picco dal software. Questa soglia può essere determinata matematicamente come fattore o deviazione standard dell'ampiezza media del segnale di picco filtrato, oppure può essere determinata preferibilmente mediante ispezione visiva di segmenti di dati <500 ms e impostata come una linea sopra il rumore del segnale in un'interfaccia utente grafica.
nota: L'intenzione nell'impostare una soglia di picco è quella di contare i picchi e ordinare le unità al fine di fornire informazioni su quanti neuroni sono attualmente registrati e come sono modellati i loro picchi.
- Abbassare lentamente gli elettrodi a microfilo di tungsteno fino a 1 mm dorsale del bersaglio, che è STN per percorso iperdiretto. Attendere che il segnale si stabilizzi, se necessario.
- Per la mappatura elettrofisiologica, far avanzare gli elettrodi ventralmente a passi di 100 μm. Ad ogni fase, valuta il modello di sparo, la velocità di sparo e la forma delle punte. Confrontateli con gli esempi tipici riportati nella Figura 1. Comunemente, i nuclei densi mostrano un picco rapido e continuo in diversi passaggi dorso-ventrali, mentre le strutture ricche di fibre mostrano bassi tassi di attivazione e un'attività di picco meno omogenea nei successivi passaggi ventrali.
- Per la via iperdiretta, assicurarsi che l'elettrodo più ventrale si trovi all'interno di STN.
nota: L'STN viene raggiunto quando viene rilevato un notevole aumento di MUA ventrale della Zona incerta. Ventrale all'STN, lo spiking si interrompe quasi completamente perché l'elettrodo ha raggiunto la capsula interna. Quando l'elettrodo più ventrale è in STN, la configurazione dei microelettrodi di tungsteno assicura che il secondo elettrodo posteriore sia in SNr. Potrebbe essere necessaria una regolazione fine dorso-ventrale in piccoli incrementi per registrare contemporaneamente il MUA tipico in STN e SNr. Si noti che la frequenza del MUA dipende dal numero di neuroni effettivamente registrati e dal livello di attivazione cerebrale.
- Una volta che gli elettrodi si trovano nelle strutture desiderate, impostare il filtraggio online e l'ordinamento degli spike (vedere la Figura 2), quindi avviare la registrazione dei dati. Esempi tipici per i diversi stati di sincronizzazione corticale che possono essere identificati nelle registrazioni LFP sono mostrati nella Figura 3.
Tabella 1: Coordinate stereotassiche per la registrazione della via iperdiretta cortico-gangli basali. Tutti i punti sono misurati dal punto di riferimento bregma sul cranio in mm; N.A.- Non applicabile.
| Coordinate da Bregma | Stn | Snr | M1 | Riferimento 1 | Riferimento 2 |
| antero-posteriore | -3.6 | -4.8 | +3.0 | -10,0 | -10,0 |
| mediale-laterale | Tel.2.5 | Tel.2.5 | +3.0 | +3.0 | -3.0 |
| dorsale-ventrale | -8.0 | n. a. | n. a. | n. a. | n. a. |
