Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione quotidiana dell'apparato sperimentale
- Accendere l'amplificatore, il computer e il sistema della fotocamera e verificare che il software sia in esecuzione.
- Posizionare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) in una provetta da 50 ml e far bollire con il carbogeno.
- Utilizzare una pompa peristaltica per far circolare l'ACSF. Regolare la velocità di flusso a circa 1 ml/min.
- Regolare l'altezza della pipetta di aspirazione in modo che il livello del liquido all'interno della camera sperimentale sia sempre costante.
nota: Il livello della soluzione è importante per ottenere una registrazione stabile, pertanto la regolazione deve essere eseguita utilizzando un micromanipolatore.
- Installare l'elettrodo di terra costituito da un chip giallo riempito con agar KCl 3 M (2%) in un supporto con un filo Ag-AgCl con una piccola quantità di soluzione KCl 3 M.
- Riempire una piccola quantità di ACSF (circa due terzi del volume) nell'elettrodo di vetro (diametro esterno 1 mm, diametro interno 0,78 mm tirato con un estrattore per micropipette) utilizzando una punta gialla affusolata e sottile e tubolare e posizionarla nel supporto dell'elettrodo.
- Fissare il supporto all'asta installata nel manipolatore. Assicurarsi utilizzando un amplifier che la resistenza dell'elettrodo sia di circa 1 MΩ.
nota: L'elettrodo a patch a gambo lungo con apertura larga (apertura da 4-8 μm) dovrebbe essere adatto per la registrazione sul campo e come elettrodo stimolante.
2. Avvio di una sessione di registrazione
- Prelevare una fetta di preparato dalla camera umida con una pinza.
- Posizionare rapidamente la fetta su una camera sperimentale al microscopio (Figura 1).
- Spingere saldamente il bordo dell'anello nell'O-ring in silicone. Fare attenzione a non rompere la membrana o il fondo della camera dell'esperimento.
nota: La direzione della fetta deve essere presa in considerazione rispetto alla direzione degli elettrodi di stimolazione e registrazione nel campo visivo. La fetta sana dovrebbe aderire al filtro a membrana, quindi non è necessario utilizzare altri dispositivi per fissare le fette come pesi e reti di nylon.
- Posizionare la punta dell'elettrodo stimolante e l'elettrodo di registrazione del potenziale di campo sulla fetta sotto il microscopio con luce trasmessa.
- Utilizzare il sistema di registrazione elettrofisiologica per verificare la risposta. Confermare la consueta registrazione elettrofisiologica (non colorata) con la configurazione data.
nota: L'elettrodo di registrazione può essere omesso ma è utile per controllare la fisiologia della fetta.
- Regolare l'intensità della luce di eccitazione a circa il 70-80% della capacità massima della fotocamera che corrisponde a 13-15 mW/cm2 sul campione quando si campiona a 10 kHz con obiettivo a immersione in acqua 5x e 1x PLAN APO tube lens. La lunghezza d'onda della luce di eccitazione è di 530 nm e il filtro di emissione deve essere > 590 nm.
nota: Utilizzare un otturatore per ridurre al minimo la quantità di luce di eccitazione. L'esposizione continua alla luce può deteriorare la fisiologia della fetta. Il possibile effetto dannoso della luce dipende dall'intensità e dalla durata della luce. Utilizzare la registrazione elettrofisiologica per giudicare l'effetto della luce. In caso di forza di 13-15 mW/cm2, circa 1 s di esposizione dovrebbe essere il limite superiore della tolleranza.
- Regolare la messa a fuoco con il sistema di acquisizione utilizzando la sorgente luminosa fluorescente perché la messa a fuoco potrebbe essere diversa a seconda della lunghezza d'onda e avviare l'acquisizione.
- Esamina i dati in un software di acquisizione immagini.
nota: Abbiamo utilizzato il pacchetto di microprogrammazione originale del software di analisi numerica per l'analisi dettagliata.
