Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Animali
- Utilizzare topi geneticamente modificati OR-IRES-tauGFP (OR = recettore olfattivo, IRES = sito di ingresso del ribosoma interno, tauGFP = proteina fluorescente tau-verde) disponibili presso il Jackson Laboratory. Questi topi sono stati sviluppati nel laboratorio del Dr. Peter Mombaerts al fine di analizzare il targeting degli assoni e lo sviluppo del sistema olfattivo. Ad esempio, la linea MOR23-IRES-tauGFP, con numero di 006643, porta il nome ufficiale del ceppo B6; 129P2-OLFR16TM2MAMMA/MAMMAJ; allo stesso modo, la linea SR1-IRES-tauGFP, codice 6717 porta il nome ufficiale B6; 129P2-OLFR124TM1Mamma/MammaJ.
- Per quanto riguarda l'età degli animali: per un migliore esito del protocollo, utilizzare animali di età compresa tra le 2 e le 4 settimane. In questa fascia di età, la dissezione è più facile (ossa più morbide, epitelio olfattivo più solido) e le protuberanze dendritiche sono più grandi rispetto agli animali più anziani.
2. Preparazione di elettrodi e soluzioni
- Per le pipette stimolanti: acquistare pipette stimolanti pre-estratte. In caso contrario, prepararli manualmente.
- Usando una fiamma, piegare sei pipette di vetro da 1 mm a circa 1 cm dalla punta. Inserire queste sei pipette più una settima guaina termorestringente diritta da 1,5 cm rinforzata da un occhiello.
- Il calore restringe il tubo per mantenere i barili attaccati insieme. Collegare un tubo termorestringente aggiuntivo all'altra estremità dei barili. Estrarre questa pipetta stimolante con un estrattore multifusto.
- Aggiungi un po' di colla liquida bianca intorno all'occhiello per rafforzare le punte piegate. Lasciare asciugare per una notte (O/N).
- Preparare 1 o 2 L di soluzione extracellulare di Ringer normale (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, glucosio 15; pH 7.6 e 305 mOsm). Conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
- Preparare la soluzione madre intracellulare (in mM): KCl 70, KOH 53, acido metansolfonico 30, acido etilenglicole tetraacetico (EGTA) 5, acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) 10, saccarosio 70; pH 7,2 (KOH) e 310 mOsm. Conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo. Buono per diverse settimane.
- Preparare la soluzione di registrazione intracellulare con nistatina estemporaneamente (all'ultimo minuto) prima dell'esperimento.
- Pesare 3 mg di nistatina, aggiungere 50 μl di dimetilsolfossido (DMSO); agitare 20 secondi, quindi sonicare 2-3 minuti fino a completa diluizione.
- Aggiungere 20 μl di soluzione di DMSO-nistatina in 5 ml di soluzione madre intracellulare. Vortice 20 sec, quindi sonicare 3 min. Mantenere questa soluzione a 4 °C e proteggere dalla luce diretta, la nistatina è sensibile alla luce. Questa soluzione può essere utilizzata per alcune ore. Sostituisci ogni giorno.
- Una volta che la preparazione dell'epitelio olfattivo è sotto il microscopio, prelevare una parte di questa soluzione in una siringa da 1 ml con una punta gialla allungata a fiamma per riempire gli elettrodi; proteggere dalla luce diretta. Una volta a temperatura ambiente (RT), la soluzione di nistatina non è stabile; Sostituire la soluzione nella siringa da 1 ml ogni ora o tenerla in ghiaccio.
- Tirare gli elettrodi di registrazione con un estrattore per ottenere un collo lungo e una punta piccola (~2 μm) con una resistenza di 15-20 MΩ con la soluzione interna di nistatina.
- Preparare la soluzione odorizzante a 0,5 M in DMSO sotto cappa aspirante; aliquotare e mantenere a -20 °C fino al momento dell'uso. Diluire l'odorante nella soluzione di Ringer fino alla concentrazione desiderata. Riempire la pipetta stimolante.
3. Preparazione dell'epitelio olfattivo
Nota: i topi OR-IRES-tauGFP esprimono la tauGFP sotto il controllo del promotore OR. In questi topi, tutti i neuroni che esprimono l'OR di interesse sono marcati con GFP. Questo protocollo è adattato per le OR espresse in tutte le zone. Tuttavia, le dissezioni e le registrazioni sono più facili per le OR espresse nella zona dorsale.
- Anestetizzare l'animale iniettando una miscela di ketamina e xilazina (rispettivamente 150 mg/kg e 10 mg/kg di peso corporeo). La decapitazione può essere eseguita con forbici affilate per i topi giovani o con una ghigliottina per roditori adeguatamente mantenuta per i topi più anziani.
- Usando le forbici da dissezione ad anello, praticare un'incisione mediale longitudinale attraverso la pelle dorsale. Rimuovere la pelle separandola. Usando le forbici, taglia le mascelle inferiori all'articolazione della mascella. Rimuovere i denti anteriori superiori con un taglio coronale parallelo ai denti.
- Fai un taglio coronale della testa dietro gli occhi e mantieni solo la parte anteriore della testa. Immergerlo in una soluzione Ringer ghiacciata per la dissezione sotto l'endoscopio.
- Sezionare sotto l'endoscopio: nel lato ventrale, eseguire un taglio longitudinale lungo la mascella superiore/i denti. Tagliare le ossa dorsali longitudinalmente, seguendo il lato dorsolaterale della cavità nasale. Rimuovere la maggior parte delle ossa e del palato; trasferire il setto e l'epitelio ad esso attaccato in Ringer ossigenato a RT.
- Per la dissezione finale: Subito prima di iniziare la sessione di registrazione, staccare l'epitelio dal setto sottostante con una pinza. Staccare l'epitelio con una pinza e con due tagli a forbice da 4-5 mm (utilizzare forbici micro-vannas) nella parte anteriore del setto dove l'adesione è più forte.
- Rimuovere con cautela l'organo vomeronasale tagliandolo lungo la sua connessione dorsale all'epitelio del setto. Trasferire l'epitelio in una camera di registrazione con lo strato di muco rivolto verso l'alto; Tienilo piatto nella camera con un'arpa.
- Installare la camera sotto un microscopio verticale dotato di ottica a fluorescenza e di una telecamera sensibile. Visualizza la preparazione sullo schermo del computer ad alto ingrandimento attraverso un obiettivo a immersione in acqua 40X (apertura numerica 0,8) e un ingrandimento extra 2X o 4X ottenuto da una lente d'ingrandimento. Perfondere continuamente con Ringer ossigenato a RT (1-2 ml/min).
4. Sessione di registrazione
- Ricerca di celle fluorescenti: eccitare la preparazione a 480 nm per EGFP, che emette luce nell'intervallo 530-550 nm; puntare su una manopola dendritica che è visibile in modo affidabile in fluorescenza e in campo chiaro.
- Riempire l'elettrodo con soluzione intracellulare con nistatina; rimuovere le bolle picchiettando delicatamente sull'elettrodo.
- Inserire l'elettrodo sul portaelettrodo, applicare una pressione positiva nella pipetta; La resistenza dovrebbe essere di 15-20 MΩ.
- Avvicinare l'elettrodo alla cella; una volta che la resistenza raggiunge ~40 MΩ, rilasciare la pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa per raggiungere un gigaseal.
- Una volta raggiunta la tenuta, impostare il potenziale di membrana a circa -75 mV;
- Una volta aperta la cellula, procedere con protocolli di stimolazione, trattamenti farmacologici. Per misurare la risposta a una singola stimolazione odorizzante, registrare 200-500 msec di attività spontanea, stimolare per 500 msec e misurare la risposta della cellula per un massimo di 10 secondi. Per i trattamenti farmacologici, perfondere gli agenti farmacologici alla concentrazione desiderata.
