Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Allineamento del percorso ottico tra la telecamera CMOS (complementary metal oxide semiconductor) e il cavo patch singolo o ramificato
- Allentare tutte le viti del traslatore a 5 assi (Figura 1B).
- Avvitare il cavo patch (Figura 1B) all'adattatore [SMA (subminiatura A) o FC (connettore in fibra ottica)] fissato al traslatore a 5 assi.
- Accendere la luce di eccitazione da 470 nm (Figura 1B) a bassa potenza (100 μW) e posizionare la punta del cavo patch rivolta verso un vetrino di plastica autofluorescente. Questo non ha alcuna influenza sulle registrazioni future, ma serve esclusivamente a visualizzare il processo di allineamento.
- Registrare dalla telecamera CMOS (Figura 1B) in modalità live. Aumentare il guadagno o regolare la tabella di ricerca (LUT) fino a quando l'immagine non è completamente nera. Il punto è essere in grado di vedere un'immagine nel punto focale dell'obiettivo (Figura 1B).
- Far avanzare il traslatore a 5 assi verso l'obiettivo, assicurandosi che la luce a 470 nm sia centrata sulla fibra all'estremità SMA o FC del cavo patch fino a quando un'immagine non può essere risolta sulla fotocamera.
- Regolare gli assi X e Y fino a quando l'immagine non è centrata e ben risolta.
- Visualizza la luce emessa dall'estremità della ghiera del cavo patch. Dovrebbe apparire come un cerchio isotropo. Se si utilizza un cavo patch ramificato, la quantità di luce emessa alle estremità della ghiera di ciascun cavo patch dovrebbe essere simile. Se il cerchio non è isotropo o la luce emessa non è uguale, regolare il traslatore a 5 assi sull'asse X-Y.
2. Impostazione delle ROI intorno alle fibre per la misurazione dell'intensità media della fluorescenza
- Accendi tutte le luci di eccitazione per visualizzare meglio le fibre. Regola il guadagno della fotocamera in modo che non siano saturi di pixel e sia presente un'immagine chiara delle fibre.
- Registra dal vivo o scatta un'immagine preliminare.
- Disegna le ROI attorno alle fibre e conservale per misurare i valori medi di intensità durante le registrazioni (Figura 1A).
- Per registrazioni in fibra multipla, verificare l'indipendenza dei segnali.
- Registrazione dal vivo da tutte le fibre.
- Punta una fibra verso una fonte di luce e picchietta con un dito. Grandi fluttuazioni dovrebbero verificarsi solo in quel canale (perdita accettabile 1:1000).
- Se i segnali non sono indipendenti, ridisegna i ROI più conservativi e ripeti il test di indipendenza.
- Etichettare e tenere traccia di quale ROI corrisponde a quale fibra, nastro colorato o smalto per unghie può essere applicato all'estremità delle fibre. Scatta una foto prima dell'inizio di qualsiasi esperimento come promemoria secondario.
3. Configurazione dell'arena di registrazione
- Appendere il cavo patch sopra l'arena utilizzando supporti, morsetti o supporti.
- Assicurati che l'animale possa muoversi liberamente in tutta l'arena, non inibito dalla lunghezza della fibra.
- Se si utilizza una scatola operativa o un campo aperto, assicurarsi che il cavo patch possa raggiungere l'animale con una flessione minima. Se ciò richiede un colpo di naso, assicurarsi che ci sia abbastanza spazio sopra la testa per evitare la flessione della fibra. Evitare di piegare o attorcigliare eccessivamente il cavo patch.
4. Registrazioni in vivo
- Ispezionare visivamente l'estremità distale delle fibre del cavo patch a occhio e con un microscopio a minifibra. Se la superficie delle fibre è graffiata, rilucidare le fibre utilizzando una pellicola lucidante/lappatrice con grana fine (1 μm e 0,3 μm).
- Pulire le estremità distali del cavo patch con etanolo al 70% e un applicatore con punta di cotone.
- Pulire le cannule in fibra ottica utilizzando etanolo al 70% e un applicatore con punta di cotone.
- Collegare l'estremità della ghiera del cavo patch alla fibra impiantata utilizzando un manicotto diviso in ceramica coperto da un tubo termoretraibile nero. Assicurarsi che il manicotto sia ben stretto durante il collegamento. In caso contrario, utilizzare una nuova sleeve.
nota: Se c'è dello spazio tra la boccola del cavo patch e l'impianto, ci sarà una grande perdita di segnale e le registrazioni non funzioneranno.
- Lasciare che l'animale si riprenda per alcuni minuti prima dell'inizio dei test comportamentali.
- Avviare la registrazione del segnale ottico ed eseguire l'esperimento.
- Durante la registrazione, tenere d'occhio la traccia in tempo reale per garantire registrazioni di qualità. Si prevede che il segnale diminuisca rapidamente in funzione del tempo nei primi 2 minuti di registrazione. Questo effetto è causato dal decadimento del LED mediato dal calore, per cui l'aumento del calore aumenta la resistenza dell'elemento ottico.
- Se si verifica un salto nel segnale che supera la cinetica di accensione/spegnimento di GCaMP, ciò spesso indica che il manicotto non è abbastanza stretto e lo spazio tra il cavo patch e l'impianto sta cambiando. In questo caso, interrompere l'esperimento e ricollegare l'animale utilizzando un nuovo manicotto.
