Uno studio elettrofisiologico delle sinapsi retinogenicolate e corticogenicolate in fette di cervello di topo

Abstract

Fonte: Chen, X., et al. Indagini elettrofisiologiche sulla funzione delle sinapsi retinogenicolate e corticogenicolate. J. Vis. Exp. (2019).

Il video descrive la registrazione elettrofisiologica delle sinapsi retinogenicolate e corticogenicolate in fette di cervello di topo. Le fette contenenti il nucleo genicolato laterale dorsale (dLGN) vengono poste in una camera di registrazione. Una pipetta stimolante è posizionata sul tratto ottico per stimolare le cellule gangliari retiniche (RGC) e studiare le sinapsi retinogenicolate o il nucleo reticolare talamo per stimolare i neuroni corticali e studiare le sinapsi corticogenicolate. Dopo la stimolazione, le RGC e i neuroni corticali rilasciano neurotrasmettitori eccitatori, che producono correnti sinaptiche nei neuroni relè LGN. Queste correnti vengono registrate utilizzando una pipetta di registrazione patch-clamp.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Soluzioni

1. Soluzione di dissezione
   1. Per ridurre l'eccitotossicità, preparare una soluzione a base di colina da utilizzare durante la dissezione come qui presentato (in mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 cloruro di colina, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 0,5 CaCl₂, 7 MgCl₂ e 25 glucosio. Preparare la soluzione di dissezione meno di 1 settimana prima dell'esperimento.
2. Soluzione di registrazione
   1. Preparare una soluzione di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente (in mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂ e 25 glucosio. Aggiungere 50 μM di acido D-2-ammino-5-fosfonovalerico (D-APV) e 10 μM di bromidrato SR 95531 (gabazina) per bloccare rispettivamente i recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) e GABAA.
3. Soluzione intracellulare
   1. Preparare una soluzione intracellulare contenente (in mM): 35 Cs-gluconato, 100 CsCl, 10 acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES), 10 acido etilenglicole tetraacetico (EGTA) e 0,1 D-600 (metossiverapamil cloridrato). Regolare il pH a 7,3 con CsOH. Filtrare, aliquotare e conservare la soluzione madre a -20 °C fino al momento dell'uso.

2. Dissezione

1. Preparare due camere a fette, di cui una riempita con 100 mL di soluzione di dissezione e l'altra con 100 mL di soluzione di registrazione. Mettere i due becher in un bagno d'acqua (37 °C) e far bollire le soluzioni con carbogono per almeno 15 minuti prima della dissezione.
2. Riempire un becher di plastica con 250 ml di soluzione di dissezione quasi ghiacciata (ma non congelata). Bollare con carbogen almeno 15 minuti prima dell'uso.
3. Riempire una capsula di Petri di plastica (100 mm x 20 mm), in cui verrà eseguita la dissezione cerebrale, con la soluzione di dissezione fredda. Metti un pezzo di carta da filtro nel coperchio della capsula di Petri.
4. Raffreddare la camera di dissezione del vibratomo.
5. Anestetizzare un topo con isoflurano al 2,5%, ad esempio nella gabbia del topo. Non appena il topo non risponde a un pizzico di coda, decapitare il topo vicino al midollo cervicale e immergere la testa nella soluzione di dissezione ghiacciata alla base della capsula di Petri.
6. Tagliare la pelle della testa da caudale a nasale e tenerla lateralmente con le dita per esporre il cranio. Per estrarre il proencefalo, tagliare prima il cranio insieme alla linea mediana posteriore-anteriore, quindi tagliare altre due volte attraverso la sutura coronale e la sutura lambdoidea (Figura 1A).
7. Rimuovere il cranio tra la sutura coronale e la sutura lambdoidea in modo che il cervello sia esposto. Tagliare il bulbo olfattivo e separare il proencefalo dal mesencefalo con una lama sottile (Figura 1B). Togliete il cervello dal cranio con una spatola sottile e mettetelo sulla carta da filtro nel coperchio della capsula di Petri.
   nota: I passaggi 2.6 e 2.7 devono essere eseguiti il più rapidamente possibile per ridurre la morte cellulare.
8. Per preservare l'integrità degli input sensoriali e corticali al dLGN nella fetta cerebrale, separare i due emisferi con un taglio parasagittale con un angolo di 3-5° (Figura 1C, D). Asciugare i piani mediolaterali delle due semisfere posizionandoli sulla carta da filtro e poi incollarli sulla fase di taglio con un angolo di 10−25° rispetto al piano orizzontale (Figura 1E).
9. Posizionare il tavolino al centro del vassoio tampone in metallo e versare delicatamente il resto della soluzione di dissezione ghiacciata nel vassoio tampone. Eseguire questo passaggio con attenzione poiché una forte colata potrebbe rimuovere il cervello incollato (Figura 1F).
10. Posizionare la vaschetta del tampone nella vaschetta piena di ghiaccio, che aiuta a mantenere la bassa temperatura durante la dissezione. Tagliare fette da 250 μm con una lama di rasoio a una velocità di 0,1 mm/s e un'ampiezza di 1 mm.
11. Conservare le fette nella camera di contenimento riempita con soluzione di dissezione ossigenata a 34 °C per circa 30 minuti, quindi lasciare che le fette si riprendano nella soluzione di registrazione a 34 °C per altri 30 minuti.
12. Dopo il recupero, rimuovere la camera di contenimento delle fette dal bagno d'acqua e mantenere le fette a temperatura ambiente (RT) fino al momento dell'utilizzo negli esperimenti.

3. Elettrofisiologia

1. Estrarre le pipette utilizzando capillari in vetro borosilicato e un estrattore di filamenti. Mantenere la resistenza delle pipette di registrazione a 3−4 MΩ. Tirare le pipette stimolanti utilizzando lo stesso protocollo, ma rompere leggermente il puntale dopo averlo tirato per aumentare il diametro. Riempire le pipette di registrazione con la soluzione intracellulare e la biocitina, mentre si riempiono le pipette stimolanti con la soluzione di registrazione.
2. Posizionare le fette nella camera di registrazione e perfondere continuamente le fette con una soluzione di registrazione ossigenata a RT. Controllare tutte le fette e selezionare quelle che mostrano un tratto ottico intatto.
3. Visualizzare la fetta e le cellule con un microscopio verticale dotato di microscopia video a contrasto interferenziale differenziale a infrarossi (IR-DIC).
   nota: I neuroni relè si differenziano dagli interneuroni per le loro dimensioni maggiori del soma e per il maggior numero di dendriti primari (rami che emergono dal soma). Gli interneuroni mostrano una morfologia bipolare con un soma più piccolo.
4. Posizionare la pipetta stimolante sulla fetta prima di applicare il cerotto alla cellula con la pipetta di registrazione. Per studiare le sinapsi retinogenicolate, posizionare la pipetta stimolante direttamente sul tratto ottico, dove sono raggruppate le fibre assonali delle cellule gangliari retiniche (Figura 2A). Per analizzare le sinapsi corticogenicolate, posizionare l'elettrodo stimolante sul nucleo reticolare talami, che è rostroventralmente adiacente al dLGN (Figura 2B).
5. Una volta che la pipetta di registrazione è stata immersa nella soluzione di registrazione, applicare un passo di tensione di 5 mV per monitorare la resistenza della pipetta. Impostare il potenziale di mantenimento su 0 mV e annullare il potenziale di offset in modo che la corrente di mantenimento sia 0 pA.
6. Avvicinarsi alla cella con la pipetta di registrazione applicando una pressione positiva. Quando la pipetta è a diretto contatto con la membrana cellulare, rilasciare la pressione positiva e impostare il potenziale di mantenimento a -70 mV. Applicare una leggera pressione negativa per consentire alla membrana cellulare di attaccarsi alla pipetta di vetro in modo tale da formare una tenuta gigaohm (resistenza >1 GΩ). Compensare la capacità della pipetta e aprire la cella mediante l'applicazione di impulsi a pressione negativa.
7. Per studiare la funzione sinaptica, applicare impulsi di corrente di 0,1 ms (circa 30 μA) tramite la pipetta di stimolazione. Se non si osservano risposte sinaptiche, potrebbe essere necessario sostituire le pipette stimolanti. Prestare attenzione quando si posizionano le pipette stimolanti in una posizione diversa, in modo che la cellula registrata non vada persa.
   nota: Nelle registrazioni di esempio mostrate nella Figura 2, la plasticità sinaptica a breve termine è stata studiata stimolando il tratto ottico o le fibre corticogenizzate due volte con intervalli interstimolanti di 30 ms. Il rapporto di impulso accoppiato (PPR) è stato calcolato dividendo l'ampiezza della seconda corrente postsinaptica eccitatoria (EPSC) per quella della prima EPSC (EPSC2/EPSC1). Ogni protocollo di stimolazione è stato ripetuto 20 volte. L'ampiezza dell'EPSC è stata misurata dalle correnti medie dei 20 sweep. L'intervallo di tempo tra ogni ripetizione era di almeno 5 s per evitare la plasticità a breve termine indotta dalle ripetizioni.
8. Monitorare continuamente la resistenza in serie applicando un passo di tensione di 5 mV. Per l'analisi utilizzare solo le celle con resistenza in serie inferiore a 20 MΩ
.

Risultati

Figura 1: Schemi che rappresentano il protocollo di dissezione. (A) Vista orizzontale del cranio del topo, che mostra la posizione dei tagli iniziali. Il primo taglio è stato eseguito insieme alla sutura sagittale, seguito da altri due tagli insieme alla sutura coronale e alla sutura lambdoide, rispettivamente. Le linee tratteggiate rappresentano le incisioni. (B) Vi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
amplificatore	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Amplificatore a doppio patch clamp
CaCl2	ASSICURARSI	Codice 1.02382.1000
cloruro di colina	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Microscopio a scansione laser confocale	Leica Microsystems	TCS SP5
CsCl	ASSICURARSI	Codice 1.02038.0100
Cs-gluconato	Auto-preparato		Poiché non esisteva un Cs-gluconato commerciale, lo abbiamo preparato da soli
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG
D-APV	Biotrend	BN0085-100
Fotocamera digitale per microscopio O	Olimpo	XM10
EGTA	SERVA	Codice 11290.02
glucosio	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	Roth	9105.2
Isolatore di stimolo ad alta corrente	Strumenti di precisione mondiali	A385
Kcl	ASSICURARSI	Codice 1.04936.1000
MgCl2	ASSICURARSI	Codice 1.05833.0250
Micromanipolatori	Luigs & Neumann	SM7
Miroscopio	Olimpo	BX51
Supporto di montaggio	ThermoFisher Scientifico	P36930
NaCl	Roth	3957.1
NaH2PO4	ASSICURARSI	Codice 1.06346.1000
NaHCO3	ASSICURARSI	Codice 1.06329.1000
pipetta	Hilgenberg	1807502
Estrattore	Sutter	P-1000
lametta	Personna	60-0138
Vibratomo Semiautomatico	Leica Biosystems	VT1200S
SR 95531 bromuro	Biotrend	AOB5680-10	Antagonista del recettore GABAA