Impianto di un sistema di microelettrodi bidirezionali wireless in un cervello di ratto

Abstract

Fonte: Melo-Thomas, L., et al., Un'interfaccia wireless e bidirezionale per la registrazione in vivo e la stimolazione dell'attività neurale in ratti che si comportano liberamente. J. Vis. Exp. (2017)

Il video mostra una procedura per impiantare un'unità di elettrodi multicanale bidirezionale wireless nel cervello di un ratto per registrare e stimolare reti neurali multicanale.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Animali

1. Alloggiare ratti Wistar adulti maschi (200-250 g) in gruppi di 3-4 in condizioni di laboratorio standard per almeno una settimana prima dell'intervento chirurgico per consentire l'acclimatazione.
2. Due giorni dopo l'intervento, ospita i ratti in coppia. Copri le gabbie singole con coperchi alti in acrilico. Evita i coperchi convenzionali realizzati con griglia metallica poiché le protesi possono bloccarsi, aumentando il rischio che si danneggino e/o diventino instabili nel tempo.

2. Chirurgia stereotassica

1. Prima di iniziare l'intervento, organizzare e preparare le seguenti attrezzature e materiali:
   1. Procurarsi un'attrezzatura chirurgica sterile composta da forbici sterili, pinze smussate, spatole, tosatrici chirurgiche, trapano dentale e cotton fioc.
   2. Procurarsi farmaci e sostanze chimiche tra cui isoflurano, xilocaina, tramadolo cloridrato, collirio dexpantenolo, perossido di idrogeno al 3%, iodio povidone ed etanolo al 70%.
   3. Procurarsi materiale di fissaggio, tra cui viti in acciaio inossidabile, resina acrilica, colla a raggi ultravioletti e protezione per cappucci.
   4. Procurarsi un'unità microelettrodo, costituita da i) un elettrodo singolo di registrazione (microelettrodo di platino e tungsteno isolato con vetro di quarzo, con forma di punta conica, diametro esterno: 80 μm, punta conica, impedenza a 1 kHz: 500 kOhm) o un tetrodo (microelettrodo a 4 conduttori di platino/tungsteno isolato con vetro di quarzo, diametro esterno: 100 μm, punta conica, impedenza a 1 kHz: 500-800 kOhm); ii) un elettrodo di stimolazione (filo di platino/iridio (90% platino, 10% iridio), diametro del nucleo 125 μm, diametro esterno 150 μm, impedenza <10 kOhm) collegato a una piastra di contatto e iii) un elettrodo di riferimento a filo di platino (diametro dello stelo, 100 μm; Figura 1A).
   5. Procurarsi un portaelettrodo incollato con colla idrosolubile all'unità microelettrodo e verificarne la funzionalità con almeno 2 ore di anticipo (Figura 1B).
   6. Ottieni un sistema collegato convenzionale composto da un preamplificatore differenziale, un amplificatore principale e un amplificatore con filtro passa-banda per le registrazioni.
   7. Procurati materiale aggiuntivo, come guanti, termoforo, siringhe e soluzione fisiologica.
   8. Procurati gabbie domestiche (L x P x A: 42 cm x 26 cm x 38 cm).
2. Procedura
   NOTA: L'impianto di elettrodi viene eseguito durante un intervento chirurgico stereotassico convenzionale in anestesia con isoflurano.
   1. Assicurarsi che lo sperimentatore indossi guanti, una maschera chirurgica e un camice da laboratorio.
   2. Iniziare l'anestesia posizionando l'animale in una camera di induzione (isoflurano 4-5%, flusso di ossigeno 1 L/min, durata ~5 min).
   3. Testare la perdita dei riflessi (riflessi della coda e delle dita dei piedi) con una pinza per confermare l'anestesia profonda.
   4. Posizionare la testa dell'animale in una maschera per anestesia fissata attorno alla barra incisiva superiore del telaio stereotassico e regolare l'anestesia (isoflurano 2-3%, flusso di ossigeno 0,7-0,8 L/min).
   5. Fissare e allineare orizzontalmente la testa dell'animale nell'apparato stereotassico utilizzando le barre auricolari e la barra incisiva superiore.
   6. Radere il campo chirurgico utilizzando un tagliacapelli chirurgico o una forbice e sterilizzare con iodio povidone.
   7. Metti l'animale su un termoforo per prevenire l'ipotermia e tratta gli occhi con un collirio a base di dexpantenolo per evitare che si secchino.
   8. Iniettare xilocaina (0,3-0,4 mL, per via sottocutanea, s.c.) al centro del campo chirurgico.
   9. Testare nuovamente la perdita di riflessi.
   10. Praticare una piccola incisione (1,5 cm) con un bisturi al centro del campo chirurgico per esporre il cranio. Separare delicatamente la pelle e rimuovere il tessuto residuo usando una pinza, forbici e una spatola.
   11. Pulisci accuratamente il cranio usando bastoncini di cotone rivestiti di perossido di idrogeno.
   12. Praticare 4-5 piccoli fori (4,7 mm) nel cranio per il fissaggio di viti in acciaio inossidabile.
   13. Collegare l'unità microelettrodo/portaelettrodo al preamplificatore e collegarlo al micromanipolatore stereotassico (Figura 1B e 1C).
   14. Praticare un foro (circa 7 mm) nel cranio sopra l'area bersaglio utilizzando le coordinate di un atlante cerebrale in base all'animale utilizzato. Nel presente studio, posizionare le punte degli elettrodi rivolte verso il collicolo inferiore utilizzando le seguenti coordinate, con il bregma che funge da riferimento: anteriore/posteriore, −8,8 mm; mediale/laterale, 1,5 mm; e dorsale/ventrale, 3,5 mm.
   15. Assorbire il sangue con i cotton fioc.
   16. Introdurre verticalmente l'unità microelettrodo fino a quando le punte degli elettrodi raggiungono l'area target.
   17. Posizionare il cavo di messa a terra lungo le viti in acciaio inossidabile e sotto la pelle.
   18. Monitora l'attività dei picchi e regola attentamente la posizione degli elettrodi con il micromanipolatore fino a raggiungere una zona di neuroni attivi nella struttura target e rileva l'attività neurale con un rapporto segnale/rumore adatto per l'ordinamento dei picchi.
   19. Fissare l'unità microelettrodo al cranio con colla ultravioletta e coprire la piastra di contatto e le viti con resina acrilica.
   20. Iniettare soluzione fisiologica (1 mL i.p.) e tramadolo (25 mg/kg, s.c.) per prevenire la disidratazione e garantire l'analgesia post-operatoria, rispettivamente.
   21. Scollegare l'unità microelettrodo dal portaelettrodo utilizzando una spazzola imbevuta di acqua.
   22. Interrompere l'anestesia e rimuovere con cura il ratto dal telaio stereotassico. Scollegare il preamplificatore dall'unità microelettrodo.
   23. Collegare la protezione del cappuccio sull'unità microelettrodo impiantata e scollegarla solo durante le procedure sperimentali.

Results

Figura 1: Unità microelettrodo TWS. (1) singolo elettrodo/tetrodo di registrazione, (2) elettrodo di stimolazione, (3) scheda di connessione in fibra di elettrodo, (4) cavi di collegamento flessibili, (5) filo di terra, (6) scheda connettore, (7) connettore maschio o femmina per sistema TWS (A); unità microelettrodo TWS collegata al preamplificatore (8) e al supporto (9); (B<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema wireless Thomas (TWS) versione 2.0	Thomas RECORDING GmbH	AN001165	Il Thomas Wireless System (TWS) versione 2.0 è un sistema di telemetria multicanale portatile con computer portatile, un sistema operativo Microsoft Windows preinstallato e un software di controllo TWS. Il TWS comprende: preamplificatore principale a 4 canali a basso rumore e programmabile con larghezza di banda fissa, stimolatore a corrente costante a canale singolo per l'applicazione di impulsi di corrente bifasici, microstimolatore programmabile via software, sistema di connettori impiantabili e un'unità di base per il montaggio su un animale. Il sistema viene fornito con un ricetrasmettitore con connessione alla porta USB per laptop o personal computer desktop, il software di controllo in esecuzione con sistema operativo Microsoft Windows. Il sistema TWS può essere utilizzato per la stimolazione neurale extracellulare e la registrazione in piccoli animali che si comportano liberamente (ad es. ratti, porcellini d'India). Questo sistema può essere adattato per essere utilizzato anche in animali più grandi (ad esempio i primati).
Software per il sistema wireless Thomas (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	incluso nel AN001165	Il software per il sistema wireless Thomas è in esecuzione con il sistema operativo Microsoft Windows e fornisce l'interfaccia utente grafica (GUI) per il sistema wireless Thomas (TWS). L'interfaccia grafica TWS offre il controllo completo delle funzioni TWS: registrazione a 4 canali e stimolazione a 1 canale.
Tetrodo impiantabile per la registrazione (4 canali) e la stimolazione (canale singolo)	Thomas RECORDING GmbH	AN001132	Tetrodo impiantabile per la registrazione (4 canali) e la stimolazione (canale singolo) per l'uso con Thomas Wireless Systems (TWS). Specifiche del tetrodo di registrazione: materiale della fibra del tetrodo: fibra di tungsteno di platino isolata in vetro di quarzo, diametro esterno della fibra del tetrodo: 100μm, forma della punta D, impedenza 0,5-0,8 MOHm; Elettrodo di riferimento: forma della punta: D; Impedenza: 300-500kOhm; Materiale: platino/tungsteno isolato in quarzo; Specifiche dell'elettrodo di stimolazione: materiale della fibra: platino/iridio, diametro: 125μm, laccato isolato, forma della punta: D, impedenza: < 10kOhm, le dimensioni dell'elettrodo possono essere specificate dall'utente finale
Microelettrodo impiantabile per la registrazione (canale singolo) e la stimolazione (canale singolo)	Thomas RECORDING GmbH	AN001118	Microelettrodo impiantabile per la registrazione (canale singolo) e la stimolazione (canale singolo) per l'uso con Thomas Wireless Systems (TWS). Specifiche dell'elettrodo di registrazione: materiale della fibra dell'elettrodo: fibra di tungsteno al platino isolata in vetro di quarzo, diametro esterno della fibra dell'elettrodo: 80μm/250μm (specificare), forma della punta D, impedenza 0,5-0,8 MOHm; Elettrodo di riferimento: forma della punta: D; Impedenza. 300-500kOhm; Materiale: platino/tungsteno isolato in quarzo; Specifiche dell'elettrodo di stimolazione: materiale della fibra: platino/iridio, diametro: 125μm, laccato isolato, forma della punta: D, impedenza: < 10kOhm
Supporto per l'impianto di elettrodi	Thomas RECORDING GmbH	AN000838	Asta metallica piegata speciale per l'impianto di microelettrodi per portaelettrodi standard. L'asta viene utilizzata per sostenere un elettrodo impiantabile. L'elettrodo impiantabile è fissato all'asta con la speciale colla idrosolubile Thomas RECORDING (AN001080). (Il portaelettrodo non è incluso)
Alimentatore di ricambio per il sistema wireless Thomas (3,7V/230mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001208	Batteria ricaricabile di ricambio (accumulatore) per il sistema wireless Thomas con una capacità di 230 mA per circa 1 ora di funzionamento. (dimensioni: 27 mm x 20 mm x 6 mm, peso circa 6 g)
Alimentatore di ricambio per l'accumulatore Thomas Wireless System (3,7V/450mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001209	Batteria ricaricabile di ricambio (accumulatore) per il sistema wireless Thomas con una capacità di 450 mA per più di 1 ora di funzionamento. (dimensioni: 48 mm x 30 mm x 4 mm, peso circa 11 g)
Caricabatterie per accumulatore ricaricabile Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	AN001207	Caricabatterie alimentato dalla rete elettrica per gli accumulatori ricaricabili Thomas Wirless System (TWS) (AN001209 e AN001209)
Colla solubile in acqua	Thomas RECORDING GmbH	AN001080	La colla per elettrodi idrosolubili Thomas RECORDING è un prodotto appositamente selezionato per l'uso con microelettrodi impiantabili nella ricerca neuroscientifica. Le sue proprietà uniche garantiscono un collegamento rigido tra l'elettrodo e il dispositivo di montaggio, sebbene sia facilmente rimovibile con acqua calda. La colla per elettrodi idrosolubile Thomas RECORDING può essere utilizzata immediatamente, senza alcuna preparazione che richiede tempo. La colla per elettrodi idrosolubile Thomas RECORDING non è dannosa per l'uomo, gli animali o l'ambiente. Quantità: 1 scatola da 10 grammi
Preamplificatore differenziale miniaturizzato	Thomas RECORDING GmbH	AN000329	Il preamplificatore differenziale miniaturizzato, modello MDPA-2 è un preamplificatore di ingresso differenziale a 2 canali progettato per registrazioni a basso rumore da tessuti eccitabili. È destinato alla registrazione extracellulare in combinazione con l'impianto di microelettrodi impiantabili per applicazioni di animali in movimento libero con il sistema wireless Thomas (TWS). Il preamplificatore differenziale miniaturizzato a 2 canali (MDPA-2) è collegato ai microelettrodi impiantabili per fornire lo stadio di amplificazione iniziale decuplicato. Idealmente, gli elettrodi Thomas RECORDING isolati in vetro-quarzo in platino/tungsteno vengono utilizzati per ottenere risultati di registrazione ottimali con elevate ampiezze di segnale e bassi livelli di rumore. L'MDPA-2 dispone di ulteriori ingressi per elettrodi di riferimento e di messa a terra comuni.
Cavo di collegamento	Thomas RECORDING GmbH	AN000330	Cavo di collegamento per collegare il preamplificatore differenziale miniaturizzato Thomas (MDPA-2) a un amplificatore principale e a un alimentatore dell'accumulatore.
Alimentatore ricaricabile per il preamplificatore miniaturizzato	Thomas RECORDING GmbH	AN000328	Alimentatore accumulatore ricaricabile per il preamplificatore differenziale miniaturizzato (MDPA-2).
Caricabatterie per accumulatori (USA)	Thomas RECORDING GmbH	AN000167	Caricabatterie per l'alimentazione AN000328 (connettore della presa di corrente di rete statunitense)
Caricabatterie per accumulatori (UE)	Thomas RECORDING GmbH	AN000168	Caricabatterie per l'alimentazione AN000328 (connettore della presa di corrente UE)
Preamplificatore differenziale/amplificatore principale/filtro passa-banda	Thomas RECORDING GmbH	AN000677	TREC AC Main Amplifier (LabAmp-03) è un amplificatore principale differenziale a canale singolo per applicazioni neurofisiologiche (ad es. registrazione extracellulare con microelettrodi). Questo strumento è progettato per funzionare con il preamplificatore differenziale miniaturizzato, modello MDPA-2. Il singolo canale del LabAmp-03 contiene uno stadio amplificatore differenziale ad alto guadagno e basso rumore seguito da filtri a bassa frequenza e ad alta frequenza. L'amplificatore ha due diversi amplificatori di filtro, un filtro-amplificatore a singola unità di attività (SUA) e un amplificatore di filtro a potenziale di campo locale (LFP), entrambi collegati in parallelo nel percorso del segnale. La modalità di registrazione offre due livelli di guadagno del segnale (x10, x100) in un primo stadio e 4 livelli aggiuntivi (x5, x10, x25 e x50) in uno stadio finale dell'amplificatore. Ogni amplificatore ha diverse caratteristiche passa-banda per attività a singola unità (SUA) 500Hz...20kHz e potenziali di campo locale (LFP) 0,1Hz...140Hz. Un monitor audio e un discriminatore a finestra sono integrati nel dispositivo. Il LabAmp-03 ha un monitor audio integrato con altoparlante. Questa unità fornisce la riproduzione audio di segnali elettrofisiologici. L'unità combina un amplificatore audio in un pacchetto compatto e robusto. Questo è particolarmente adatto per monitorare l'attivazione neurale e le contrazioni muscolari. L'ingresso del monitor audio è collegato internamente all'uscita dell'amplificatore SUA-Filter. Il LabAmp-03 viene fornito con alimentatore esterno per un intervallo di tensione di funzionamento con alimentazione di rete di 100-240 V CA/50-60 Hz.
Oscilloscopio USB	Thomas RECORDING GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 canali. Questo oscilloscopio per PC a 2 canali è perfetto per l'uso mobile su un laptop e per l'installazione permanente in armadi di controllo, apparecchiature industriali e molte altre applicazioni in cui è richiesto un oscilloscopio piccolo, leggero e potente. Questo oscilloscopio è collegato all'uscita del segnale dell'amplificatore principale per la visualizzazione dell'attività extracellulare registrata durante l'implanazione dei microelettrodi impiantabili per il sistema wireless Thomas (TWS). L'utente può acquisire i dati di misura tramite le diverse interfacce dati direttamente sul PC con software per PC incluso.
Generatore di stimoli	Sistemi multicanale	STG3008-FA	Il generatore di stimoli per la stimolazione guidata dalla corrente (STG) e la stimolazione guidata dalla tensione svolgono tre funzioni: stimolazione guidata dalla corrente, stimolazione guidata dalla tensione, controllo e temporizzazione. L'STG è disponibile con 2, 4 o 8 canali di uscita indipendenti. Dotato di unità di isolamento integrate per ogni canale di uscita, l'STG è in grado di fornire qualsiasi forma d'onda arbitraria.
Protezione del cappuccio per l'elettrodo	Thomas RECORDING GmbH	AN001193	Cappuccio di protezione per unità elettrodo impiantabile per il sistema wireless Thomas
Attrezzature chirurgiche			Forbici, pinze smussate, spatole, tosatrici chirurgiche, trapano dentale e cotton fioc
Farmaci e prodotti chimici			isoflurano, xilocaina, tramadolo cloridrato (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Germania), collirio dexpantenolo (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Germania), perossido di idrogeno al 3%, iodio povidone (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburgo, Germania) ed etanolo al 70%;
Materiale di fissaggio incluso			Viti in acciaio inox (BN650 M1,2x5; 4,7 mm), resina acrilica (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Germania), colla ultravioletta (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Germania) e protezione del cappuccio (Thomas Recording GmbH, Giessen, Germania);
Materiale aggiuntivo			Guanti, termoforo, siringhe e soluzione fisiologica.
Strumento stereotassico per piccoli animali (SASI)	Thomas RECORDING GmbH	AN000287	Il modello deve essere scelto in base all'animale (ratto, porcellino d'India, scimmie, ecc.) utilizzato nello studio
videocamera	EverFocus		EverFocus, modello: EQ150