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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Soluzioni per registrazioni di slice acute
- Preparare soluzioni stock di 10 soluzioni di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) (124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4 e 11 mM D-glucosio) in acqua deionizzata pura prima degli esperimenti di elettrofisiologia. Conservare la soluzione a 4 °C in flacone da 1 L senza CaCl2 e MgCl2.
- Preparare la soluzione della pipetta a base di gluconato di potassio in modo che contenga 135 mM di K-gluconato, 1,2 mM di KCl, 10 mM di HEPES, 0,2 mM di EGTA, 2 mM di MgCl2, 4 mM di MgATP, 0,4 mM di Tris-GTP, 10 mM di Na 2-fosfocreatina e 2,7-7,1 mM di biocitina per la rivelazione post-hoc della morfologia cellulare. Regolare il pH della soluzione a 7,3 e l'osmolarità a 290 mOsm. Conservare 1 mL di aliquote a -20 °C.
2. Registrazione patch-clamp su celle intere
- Trasferire delicatamente una fetta di cervello contenente il complesso ippocampale con una pipetta di trasferimento in vetro su misura nella camera di registrazione montata su un microscopio verticale. Una pipetta di trasferimento è costituita da una pipetta Pasteur accorciata (diametro interno 6,5 mm) attaccata a un bulbo di pipetta in gomma. Perfondere continuamente la camera di registrazione (3 mL) con aCSF a 34 °C (riscaldato) gorgogliato con 95%/5% di O2/CO2. Impostare la velocità della pompa peristaltica a 2-3 mL/min.
- Esaminare brevemente l'espressione di Chronos-GFP nei terminali degli assoni nella regione di interesse con illuminazione a LED blu (470 nm) e osservare con un obiettivo 4x. La fluorescenza GFP viene visualizzata attraverso un filtro di emissione appropriato, con l'immagine di una telecamera CCD visualizzata sullo schermo di un computer.
- Posiziona un'ancora a fette realizzata con un filo di platino a forma di U con corde di nylon ben distanziate ("arpa") sulla fetta per mantenerla.
- Passa a un obiettivo a immersione 63x e regola la messa a fuoco. Verificare la presenza di assoni che esprimono Chronos-GFP e scegliere un neurone piramidale per la registrazione delle patch.
- Sposta l'obiettivo verso l'alto.
- Estrarre le pipette utilizzando un estrattore per elettrodi Brown-Flaming in vetro borosilicato. L'estrattore è impostato per produrre pipette con un diametro del puntale di circa 1 μm. Riempire le pipette con una soluzione interna a base di K-gluconato.
- Montare la pipetta nel portapipetta sullo stadio della testa. Abbassare la pipetta nella camera e trovare la punta sotto l'obiettivo. La resistenza della pipetta deve essere compresa tra 3 e 8 MΩ. Applicare una leggera pressione positiva con una siringa in modo da vedere un cono di soluzione fuoriuscire dalla pipetta e abbassare progressivamente la pipetta e l'obiettivo sulla superficie della fetta.
- Applicare il patch alla cellula in configurazione voltage-clamp: avvicinarsi al neurone identificato e premere delicatamente la punta della pipetta sul soma. La pressione positiva dovrebbe produrre una fossetta sulla superficie della membrana. Rilasciare la pressione per creare una tenuta giga-ohm (resistenza >1 GΩ). Una volta sigillato, impostare la tensione di mantenimento a -65 mV. Rompere la membrana con un forte impulso di pressione negativa: ciò si ottiene applicando una forte aspirazione a un tubo collegato al supporto della pipetta.
- Registra in modalità di morsetto di corrente a cellula intera le risposte del neurone ai passaggi di corrente iperpolarizzanti e depolarizzanti (Figura 1A).
nota: Questo protocollo verrà utilizzato per determinare le proprietà intrinseche attive e passive della cellula. Per l'analisi off-line vengono utilizzate routine MATLAB scritte su misura.
- Registrare le risposte postsinaptiche in current- o voltage-clamp alla stimolazione LED a campo intero a 475 nm di fibre afferenti che esprimono Chronos. Stimolare con treni di 10 stimolazioni della durata di 2 ms a 20 Hz (Figura 1 B, C). L'intensità della luce può variare da 0,1 a 2 mW.
nota: L'intensità della luce è stata misurata con una console di alimentazione ottica digitale portatile dotata di un sensore a fotodiodo, posizionato sotto l'obiettivo. Le latenze di risposta di 2-4 ms sono caratteristiche per una connessione monosinaptica.
