Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione di hardware e software per registrazioni multicanale
- Configurare un sistema di acquisizione dati a 16 canali secondo le istruzioni del produttore.
nota: Diversi amplificatori e sistemi di acquisizione dati disponibili in commercio possono essere utilizzati per raccogliere registrazioni multicanale. Negli esperimenti qui descritti, i segnali analogici vengono inviati tramite un pannello di riferimento degli elettrodi a due amplificatori, dove vengono amplificati (2000x) e filtrati (0,1-10kHz). Gli ingressi analogici al sistema di acquisizione dati sono digitalizzati a 40kHz.
- Fissare l'adattatore per stadio di testa a 16 canali appropriato a un micromanipolatore per microscopio. Orientare l'adattatore in modo che le porte del connettore femmina siano rivolte verso il basso.
- Regolare l'angolo di funzionamento di questo micromanipolatore in modo che sia orientato verso il basso verso la camera di registrazione con un angolo di circa 70° rispetto all'orizzontale.
- Collegare l'ingresso dell'headstage a una sonda 16 x 1 per l'elettrofisiologia in vitro tramite l'adattatore dell'head stage ancorato al micromanipolatore.
- Collegare il connettore di uscita dello stadio principale al sistema di acquisizione dati.
- Installare il software appropriato per l'acquisizione dei dati. Configura 15 canali di ingresso in modo che corrispondano ai segnali di ingresso dai primi 15 contatti della sonda multicanale. Configurare il canale rimanente per ricevere l'input dall'elettrodo intracellulare.
nota: Durante la raccolta e l'analisi dei dati, fare attenzione a considerare le mappe degli elettrodi e degli adattatori per garantire che il segnale appropriato corrisponda al contatto dell'elettrodo da cui è stato raccolto.
2. Configurazione dei protocolli di stimolazione luminosa
- Configurare un sistema di erogazione della luce e installare il software in dotazione.
- Apri il software. Scegliere una configurazione di cablaggio hardware in cui una sorgente di trigger (digitale/TTL (transistor-transistor logic) Out) fornisce un segnale di trigger in al sistema di erogazione della luce e il sistema di erogazione della luce fornisce un segnale di trigger out a un LED da 470 nm (diodo a emissione di luce).
- Monta l'obiettivo ad alta potenza. Utilizzando una fotocamera digitale, calibrare gli obiettivi ad alta potenza con il sistema di erogazione della luce.
- Creare una nuova sequenza di profili di stimolazione luminosa.
- Crea un modello a scelta. Negli esperimenti qui descritti, un cerchio di diametro 150 μm consente l'attivazione layer-specific dei terminali degli assoni.
- Per creare una sequenza di profili, copiate e incollate questo profilo per ognuna delle varie prove.
- Creare un elenco di forme d'onda che contenga forme d'onda di qualsiasi intensità luminosa, durata dell'impulso o numero di impulsi.
- Assegna in modo casuale le forme d'onda a ciascun profilo. Ogni profilo con la forma d'onda assegnata corrisponde a un impulso di trigger da un ingresso TTL digitale o da una prova.
- Salvare la sequenza del profilo.
- Nel software di acquisizione dati, creare un nuovo protocollo.
- Impostare il numero di prove in modo che corrisponda al numero di profili nella sequenza di profili creata.
- Scegliere gli ingressi del segnale in modo che corrispondano a quelli configurati nel passaggio 1.6. Configura un protocollo che fornisca una singola uscita TTL digitale, registrando da questi 16 canali di ingresso per un periodo di tempo appropriato prima e dopo il trigger digitale.
3. Posizionamento di una sonda multicanale in una fetta di tessuto cerebrale ex vivo
- Perfuse bolle eACSF (Experimental Artificial cerebrospinal Liquid) (non in sacchetti sigillati) a 3-6 mL/min.
- Trasferire la fetta di cervello contenente un'area di interesse sulla griglia a maglie in una camera di perfusione per microscopio. Ancora con arpa platino
- Ruotare la griglia a maglie in modo che la linea dei contatti degli elettrodi sull'estremità distale della sonda multicanale sia approssimativamente perpendicolare alla superficie del piale.
- Abbassare la sonda multicanale verso la superficie della fetta sotto l'illuminazione a campo largo e il controllo preciso del micromanipolatore.
- Ruotare la torretta del cubo filtrante per attivare il cubo filtrante appropriato per visualizzare la proteina reporter fluorescente espressa nei terminali assonici delle afferenze corticali. Se necessario, ruotare la fetta per allineare con maggiore precisione la sonda con la superficie del pial.
- Posizionare la sonda appena sopra il piano della fetta, ~200 μm in meno rispetto alla posizione finale del bersaglio lungo l'asse x, lasciando almeno un canale al di fuori del confine dell'area di tessuto da registrare.
- Inserire lentamente la sonda nella fetta spostando il manipolatore lungo il suo asse longitudinale. Per ridurre al minimo i danni al tessuto, far avanzare la sonda solo nella misura in cui le punte affilate sono appena visibili sotto la superficie del tessuto. Ciò ridurrà al minimo i danni al tessuto, garantendo comunque che i contatti degli elettrodi siano a contatto con il tessuto.
4. Patch clampaggio di neuroni mirati e ottenimento della configurazione di intere cellule
- Commutazione dell'origine eACSF alla soluzione di controllo in buste.
- Identifica le cellule marcate in fluorescenza per la registrazione mirata del patch clamp.
- Limitare il diaframma del diaframma dell'apertura al diametro più piccolo. Attiva una lente dell'obiettivo a bassa potenza e metti a fuoco il tessuto.
- Centrare la luce su un'area di tessuto adiacente (ma non sovrapposta) alla sonda multicanale.
- Innestare l'obiettivo a immersione in acqua ad alta potenza (40x o 60x), prestando attenzione per evitare il contatto tra la sonda multicanale e la lente dell'obiettivo.
- Ruotare la torretta del cubo del filtro per attivare il set di filtri appropriato per consentire l'imaging di cellule che esprimono un marcatore fluorescente Cre-dipendente.
- Identificare una cella marcata in modo fluorescente come destinazione per la registrazione del patch clamp. Sollevare la lente dell'obiettivo per creare ampio spazio per abbassare una pipetta per cerotto.
- Caricare una pipetta patch (vedere Tabella 1) con soluzione interna (Tabella 2) e montare la pipetta nel portaelettrodo. Utilizzando una siringa da 1 ml, applicare una pressione positiva corrispondente a ~0,1 ml di aria.
- Immergere la pipetta per cerotti nella soluzione. Mettere a fuoco il puntale della pipetta sotto guida visiva.
- Ottenere la registrazione dell'intera cellula dalla cellula di destinazione utilizzando i passaggi precedentemente dimostrati33.
- Se si prevede di valutare le modifiche alle proprietà intrinseche della cella (ad esempio, resistenza all'ingresso, velocità di attivazione del potenziale d'azione in risposta alle fasi correnti), condurre queste registrazioni. In caso contrario, passare al protocollo di stimolazione degli assoni riportato di seguito.
Tabella 1: Composizione del liquido cerebrospinale artificiale e della soluzione intracellulare. Vengono elencati i reagenti e le concentrazioni per eACSF e la soluzione di pipetta intracellulare per le registrazioni con patch clamp.
| Esperimento ACSF, eACSF (in mM) |
| NaCl | 111 |
| NaHCO3 | 35 |
| HEPES | 20 |
| Kcl | 1.8 |
| CaCl2 | 2.1 |
| MgSO4 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 |
| glucosio | 10 |
| Soluzione interna |
| K-gluconato | 140 |
| NaCl | 10 |
| HEPES | 10 |
| EGTA | 0,1 |
| MgATP | 4 |
| NaGTP | 0,3 |
| pH = 7,2 |
