Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparativi prechirurgici
- Preparazione della soluzione dell'elettrodo
- Per preparare la soluzione di riempimento dell'elettrodo, preparare una soluzione di acetato di potassio 4 M con 140 mM di cloruro di potassio.
- Preparazione degli elettrodi
- Utilizzando l'aspirazione a vuoto, inserire una fibra di carbonio T-650 (7 μm di diametro) in un capillare di vetro borosilicato (lunghezza = 100 mm, diametro = 1,0 mm, diametro interno = 0,5 mm).
- Una volta che la fibra di carbonio è stata posizionata all'interno del capillare di vetro, posizionare il capillare di vetro in un estrattore di elettrodi verticale, con l'elemento riscaldante all'incirca al centro del capillare. Impostare il riscaldatore su 55 con il magnete spento.
- Dopo aver tirato il capillare, sollevare con cautela il supporto del capillare superiore in modo che la punta dell'elettrodo non sia circondata dall'elemento riscaldante.
- Utilizzando delle forbici affilate, tagliare la fibra di carbonio che sta ancora collegando i due pezzi del capillare. Ciò si tradurrà in due microelettrodi in fibra di carbonio separati.
- Al microscopio ottico, tagliare con cura la fibra di carbonio esposta con un bisturi affilato in modo che si estenda di circa 75-100 μm oltre l'estremità del vetro.
- Utilizzando un microscopio ottico, assicurarsi che l'elettrodo sia privo di crepe lungo il capillare e che la guarnizione nel punto in cui la fibra di carbonio esce dal capillare sia difficile da notare e priva di crepe.
nota: Una buona tenuta aiuterà a ridurre il rumore durante le registrazioni.
- Fabbricazione di elettrodi di riferimento
- Saldare uno spillo d'oro a un filo d'argento di 5 cm.
- Collegare l'anodo a una graffetta metallica o a un altro conduttore, il catodo a un perno e applicare una tensione (~2 V) mentre la graffetta e il filo d'argento sono immersi in HCl 0,1 M.
- Interrompere la tensione quando appare un rivestimento bianco (AgCl) sul filo d'argento.
- Preparazione degli elettrodi per l'impianto
- Saldare un perno d'oro a un filo sottile isolato (~10 cm di lunghezza, <0,50 mm di diametro).
- Rimuovere ~5 cm di isolamento dal filo opposto al perno dorato.
- Riempire l'elettrodo circa a metà con la soluzione dell'elettrodo.
- Inserire il filo isolato nell'elettrodo.
nota: Il filo deve entrare in contatto con la fibra di carbonio all'interno dell'elettrodo.
2. Impianti di elettrodi
- Somministrare a ratti Sprague Dawley adulti, maschi (250-450 g) un'iniezione intraperitoneale (1,5 g/kg o 1 mL/kg di volume) di 0,5 g/mL di uretano disciolto in soluzione fisiologica sterile. Inizia con una dose iniziale di uretano di 1,0-1,2 g/kg. Se l'animale risponde ancora al test di stimolo nocivo (pizzicamento della coda) 20 minuti dopo la somministrazione di uretano, somministrare ulteriori 0,3-0,5 g/kg di uretano per una dose totale di 1,5 g/kg.
nota: Per preparare la soluzione di uretano da 0,5 g/mL, aggiungere 10 g di uretano a 10 g (~10 mL) di soluzione fisiologica. L'uretano è cancerogeno e deve essere maneggiato con cura. Tuttavia, è un anestetico importante, in quanto non altera i livelli di dopamina, come fanno altri anestetici come la ketamina/xilazina e l'idrato di cloralio.
- Una volta che l'animale è profondamente anestetizzato e non risponde a stimoli nocivi (ad esempio, pizzicare le dita dei piedi), posizionarlo nel frame stereotassico. Applicare lubrificante oftalmico su ciascun occhio del ratto.
nota: Questo è un intervento chirurgico non di sopravvivenza, ma una buona tecnica asettica è incoraggiata.
- Pulire il cuoio capelluto del ratto utilizzando uno scrub in due fasi (ad esempio, uno scrub allo iodopovidone seguito da uno scrub al 70% di etanolo; eseguire con una ripetizione di 3 cicli).
- Tagliare il tessuto del cuoio capelluto utilizzando pinzette sterilizzate e forbici chirurgiche. Rimuovere una quantità significativa di tessuto per fare spazio ai vari impianti descritti di seguito.
- Pulire delicatamente la superficie del cranio utilizzando applicatori di cotone sterilizzato. Quindi applicare 2-3 gocce di perossido di idrogeno al 3% per aiutare a identificare la lambda e la bregma.
- Utilizzando un trapano stereotassico o a mano (1,0 mm, ~20.000 giri/min), praticare un foro di 1,5 mm di diametro 2,5 mm anteriormente alla bregma e 3,5 mm lateralmente alla bregma. Impiantare parzialmente (circa a metà, fino a quando non è saldamente in posizione) una vite (1,59 mm di diametro esterno, 3,2 mm di lunghezza) in questo foro. Si consiglia di utilizzare soluzione fisiologica sterile per irrigare durante la perforazione per evitare lesioni termiche.
- Per l'elettrodo di riferimento, praticare un foro di 1,0 mm di diametro 1,5 mm anteriormente e 3,5 mm lateralmente alla bregma, nell'emisfero sinistro.
- A mano, inserire ~2 mm di filo di riferimento in questo foro mentre si avvolge il filo di riferimento attorno e sotto la testa della vite impiantata.
- Impiantare completamente la vite, fissando l'elettrodo di riferimento in posizione.
- Nell'emisfero destro, praticare un foro di 1,5 mm di diametro, 1,2 mm anteriormente e 1,4 mm lateralmente alla bregma.
- Rimuovere delicatamente la dura madre utilizzando una pinzetta.
- Per l'elettrodo stimolante, praticare un foro quadrato (2 mm antero-posteriore, 5 mm mediale-laterale) centrato a 5,2 mm posteriormente e 1,0 mm lateralmente alla bregma.
- Utilizzando le barre stereotassiche del braccio, abbassare l'elettrodo/cannula guida stimolante bipolare di 5 mm sotto la dura. In caso di sanguinamento durante l'impianto dell'elettrodo, utilizzare tamponi di cotone sterili e garze per ridurre al minimo il sanguinamento.
nota: L'elettrodo stimolante bipolare utilizzato in questo metodo è premontato da una cannula guida (Tabella dei materiali). La cannula interna utilizzata con questo articolo deve essere lavata con i rebbi dell'elettrodo stimolante bipolare quando è completamente inserita nella cannula guida. Ciò consentirà alla cannula interna di posizionarsi direttamente tra i due rebbi dello stimolatore, che si trovano a circa 1 mm di distanza. Un protocollo simile è descritto altrove.
- Utilizzando le barre stereotassiche del braccio, abbassare il microelettrodo in fibra di carbonio 4 mm sotto la dura. Questa posizione è nella parte più dorsale dello striato.
- Collegare il filo di riferimento e la fibra di carbonio a un potenziostato.
- Applicare una forma d'onda triangolare (-0,4-1,3 V, 400 V/s) per 15 minuti a 60 Hz e di nuovo per 10 minuti a 10 Hz.
nota: In genere, quando si applicano forme d'onda ai microelettrodi in fibra di carbonio nel cervello, i gruppi di ossido vengono aggiunti alla superficie della fibra di carbonio. L'equilibrio di questa reazione deve essere raggiunto prima della registrazione; In caso contrario, si verificherà una deriva significativa19. Il ciclo dell'elettrodo a frequenze più elevate (60 Hz) consente alla fibra di carbonio di raggiungere l'equilibrio più velocemente.
3. Ottimizzazione della fibra di carbonio e stimolazione delle posizioni degli elettrodi/cannule guida
- Impostare lo stimolatore in modo che produca una forma d'onda elettrica bipolare, con una frequenza di 60 Hz, 24 impulsi, corrente di 300 μA e un'ampiezza dell'impulso di 2 ms/fase.
- Abbassare delicatamente lo stimolatore con incrementi di 0,2 mm da 5 mm a 7,8 mm sotto la dura dura. Ad ogni incremento, stimolare il VTA.
nota: A profondità più profonde (5-6 mm), la stimolazione del cervello provoca tipicamente (~80% delle volte) la contrazione dei baffi del ratto. A profondità più elevate, i baffi cesseranno di contrarsi, che si verifica tra 7,5 e 8,2 mm sotto la dura dura. Quando i baffi smettono di contrarsi, l'elettrodo stimolante sarà vicino o in corrispondenza del VTA. Questo non si verificherà in tutti i ratti e la mancanza di contrazioni dei baffi non deve essere considerata come un segno che l'elettrodo stimolante bipolare/cannula per infusione è mal posizionato. Le contrazioni dei baffi potrebbero non verificarsi per tutti gli anestetici (ad es. isoflurano).
- Continuare ad abbassare l'elettrodo stimolante bipolare/la cannula guida fino a quando una stimolazione produce un rilascio fasico di DA al microelettrodo in fibra di carbonio (attualmente nello striato dorsale).
nota: Il rilascio di DA nello striato dorsale non si verificherà sempre se l'elettrodo bipolare è impiantato nel VTA, ma l'osservazione del rilascio di DA nello striato dorsale dopo stimolazione VTA è di solito un buon segno che si osserverà un buon segnale nel nucleo di NAc.
- Abbassare il microelettrodo in fibra di carbonio fino a quando non si trova almeno 6,0 mm sotto la dura. Questa è la parte più dorsale del nucleo di NAc.
- Stimola il VTA e registra l'ampiezza del picco DA.
- Abbassare o sollevare il microelettrodo in fibra di carbonio nel sito che produce il maggior rilascio di DA.
- Assicurarsi che il picco di risposta DA sia un chiaro picco di ossidazione a 0,6 V e un picco di riduzione a -0,2 V. Questi picchi indicano DA.
4. Registrazione FSCV combinata di infusione e stimolazione
NOTA: La Figura 1 mostra la cronologia per la registrazione prima e dopo la microinfusione VTA.
- Una volta ottimizzata la fibra di carbonio e la posizione dell'elettrodo/cannula guida/stimolante, stimolare per ~20-30 min.
nota: In base agli attuali parametri di stimolazione, non stimolare più di una volta ogni 3 minuti, per consentire la ricarica vescicolare22.
- Dopo aver raggiunto una linea di base stabile (variazione del <20% su cinque stimolazioni), abbassare delicatamente la cannula interna a mano nella cannula guida preinserita nello stimolatore bipolare.
- Effettuare ulteriori 2-3 registrazioni di base per assicurarsi che l'inserimento della cannula stessa non abbia modificato il segnale evocato. In alcuni casi, l'inserimento e la rimozione della cannula interna possono danneggiare il VTA. Se il segnale cambia drasticamente durante questo periodo di riferimento (>20%), eseguire ulteriori 3-4 registrazioni fino a quando la linea di base non si ristabilizza.
- Utilizzando una pompa a siringa e una micro siringa, infondere 0,5 μL di soluzione (ad es. soluzione fisiologica allo 0,9%, N-metil-D-aspartato [NMDA], acido (2R)-ammino-5-fosfonovalerico [AP5]) nel VTA per un periodo di 2 minuti.
- Dopo l'infusione, lasciare la cannula interna per almeno 1 minuto prima della rimozione.
nota: Alcuni farmaci possono richiedere di lasciare la cannula interna per un tempo più lungo in base alla cinetica del farmaco e la rimozione della cannula interna può far risalire il farmaco attraverso la cannula interna. In caso di dubbi, si potrebbe lasciare la cannula interna nella cannula guida durante l'intera registrazione. In caso contrario, la registrazione può iniziare dopo questo intervallo di 1 minuto.
- Continuare a registrare ogni 3 minuti per misurare gli effetti post-infusione.
nota: Se si infonda una soluzione di controllo e non si osserva alcun effetto, è possibile infondere una seconda volta10. Se c'è un rilascio alterato di DA causato dall'inserimento della cannula interna o dell'infusione salina, il segnale in genere recupera al basale entro 30 minuti.
