Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Sigillatura delle celle per la registrazione
- Assicurarsi che tutte le apparecchiature (microscopio, amplificatore, digitalizzatore, micromanipolatore e altri) siano accese prima di iniziare la registrazione.
- Riempire la camera di registrazione, di un marchio commerciale (Tabella dei materiali), collegarla al microscopio con la soluzione aCSF per le registrazioni. Utilizzare una pompa di perfusione per perfondere costantemente l'aCSF a una velocità di 2 mL/min.
- Trasferisci una fetta di cervello di interesse (una alla volta) nella camera di registrazione. Utilizzare una pipetta di trasferimento in acrilico (pipetta in vetro Pasteur rovesciato collegata a una tettarella in silicone) per trasferire le fette ipotalamiche nella camera. Utilizzare un'ancora di sezione (Tabella dei materiali) per tenere la sezione in modo che non si muova durante la perfusione aCSF.
- Posizionare una fetta al centro della camera di registrazione collegata al microscopio. La posizione della fetta è fondamentale per consentire una buona visione della regione desiderata al microscopio e per una perfetta portata della micropipetta di registrazione.
- Utilizzare l'obiettivo a bassa potenza di un microscopio a immersione (10x o 20x) per facilitare il posizionamento della fetta e l'individuazione della regione di interesse.
- Dopo aver individuato la regione di interesse, passare dalla lente dell'obiettivo alla lente ad alta potenza (63x) e concentrarsi sul livello del tessuto, osservando la proteina fluorescente endogena e le forme delle cellule nella regione bersaglio per localizzare le cellule della kisspeptina sulla superficie della fetta di cervello.
- Quando viene individuata una possibile cella di destinazione, contrassegnala sullo schermo del computer con il cursore del mouse o disegnando un formato, come un quadrato, sull'area di interesse. Lo screen mark del computer aiuta a guidare la posizione della micropipetta di registrazione verso la cellula.
- Dopo aver determinato la posizione esatta della cellula target, sollevare l'obiettivo e introdurre la micropipetta di registrazione riempita con la soluzione interna. Quando si posiziona la micropipetta nel portaelettrodo, assicurarsi che la soluzione interna sia a contatto con l'elettrodo d'argento.
nota: Per la preparazione, il posizionamento e il posizionamento delle micropipette sul portaelettrodo.
- Applicare una pressione positiva prima di immergere la micropipetta nella soluzione aCSF, per evitare che i detriti entrino nella micropipetta, utilizzando una siringa riempita d'aria da 1-3 ml collegata al supporto della micropipetta attraverso un tubo in polietilene (≈130 cm più lungo); applicare quasi 100-200 μL di aria.
- Utilizzando il micromanipolatore, guidare la micropipetta sotto il centro dell'obiettivo. Spostare i pulsanti sul micromanipolatore per guidare la micropipetta sull'asse X-Y-Z verso la cellula di interesse.
- Regolare la messa a fuoco per vedere la punta della micropipetta e avvicinare la messa a fuoco, ma non troppo, alla fetta. Ridurre la velocità del micromanipolatore e abbassare lentamente la micropipetta sul piano di messa a fuoco. Assicurarsi che la punta della micropipetta non penetri bruscamente nella fetta, ma scenda lentamente fino a toccare la superficie della cellula/regione target.
- Applicare una leggera pressione positiva (≈100 μl) con la siringa riempita d'aria da 1-3 ml collegata al supporto della micropipetta per eliminare eventuali detriti dal percorso di avvicinamento.
- Concentrati sulla cellula bersaglio e muovi lentamente il micromanipolatore sull'asse X-Y-Z per avvicinare la micropipetta ad essa. Quando si tocca la micropipetta con la cellula, si osserva una fossetta causata dalla pressione applicata attraverso la punta della micropipetta (Figura 2C).
- Dopo aver formato la fossetta, a causa della vicinanza della micropipetta alla cellula, applicare una leggera e breve aspirazione a bocca (1-2 s) attraverso il tubo collegato al supporto della micropipetta per generare la tenuta tra la micropipetta e la cella (sigillo gigaohm o gigaseal >1 GΩ; Figura 2D). Per formare il sigillo, utilizzare la modalità voltage-clamp sul software.
- Se la tenuta rimane stabile (la tenuta gigaohm deve essere meccanicamente stabile e senza interferenze di rumore, determinata dall'osservazione per circa 1 minuto), impostare la tensione di mantenimento al potenziale di riposo fisiologico più vicino della cella di interesse. Per i neuroni ipotalamici kisspeptina, si raccomanda -50 mV.
- Applicare una breve aspirazione per bocca (pressione negativa) con la micropipetta sigillata alla cellula per rompere la membrana plasmatica (Figura 2E). Un'adeguata configurazione dell'intera cellula si ottiene quando l'aspirazione viene eseguita con una forza sufficiente in modo che la membrana rotta non ostruisca la micropipetta e non attragga una parte considerevole della membrana o addirittura della cellula.
- Controllare il manuale delle impostazioni di sistema utilizzato. Utilizzare il software (vedere la tabella dei materiali) per controllare e calcolare digitalmente la resistenza in serie (SR) e la capacità dell'intera cella (WCC).
- In modalità voltage-clamp, dopo aver rotto la membrana cellulare, abilitare l'opzione dell'intera cella e fare clic sul comando Auto facendo riferimento alla scheda dell'intera cella. L'SR e il wcc della cella verranno calcolati automaticamente e visualizzati istantaneamente dal software. Questi parametri possono essere verificati anche eseguendo il test della membrana con l'amplificatore menzionato nella Tabella dei Materiali.
- Assicurati di controllare i parametri di vitalità cellulare. Per i neuroni kisspeptina, verificare che le misurazioni elettrofisiologiche siano: SR < 25 mΩ, resistenza di ingresso > 0,3 GΩ e mantenimento del valore assoluto della corrente < 30 pA. Il valore medio del WCC dei neuroni AVPV/PeNKisspeptin o ARHkisspeptina è ≈ 10-12 pF nei topi con gonadi intatte.
- Monitorare la capacità SR e la capacità stazionaria della cella durante gli esperimenti. Assicurarsi che l'SR non cambi di oltre il 20% durante una registrazione e che la capacità della membrana sia stabile.
- Controlla le impostazioni del software. Creare protocolli specifici per le registrazioni in base al tipo di esperimento. Per registrare il potenziale di membrana in modalità current-clamp, con le apparecchiature menzionate nella Tabella dei materiali, filtrare i segnali elettrofisiologici a 2-4 kHz e analizzare i risultati offline nel software (vedere la Tabella dei materiali per informazioni sul software).
- Una volta ottenuta correttamente la configurazione dell'intera cella, misurare le correnti sinaptiche in modalità voltage-clamp (Figura 2G). Registrare le variazioni del potenziale di membrana a riposo (RMP) e le variazioni RMP indotte nella modalità di clamp di corrente (Figura 2H). Cambiamenti nella RMP, come la depolarizzazione della membrana cellulare, possono essere indotti somministrando un farmaco/neurotrasmettitore noto al bagno (descritto nel passaggio 1.2), come illustrato nella Figura 1.
nota: In modalità pinza amperometrica, la corrente positiva o negativa può essere iniettata per mantenere la tensione della membrana alla tensione desiderata. Per i neuroni kisspeptina, di solito impostiamo l'iniezione di corrente zero (I = 0) per registrare la variazione spontanea del potenziale di membrana.
