Valutazione basata su array di microelettrodi delle reti neuronali in fette di midollo spinale di topo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Elettrofisiologia in vitro

1. Preparazione di soluzioni per la preparazione e la registrazione di fette di midollo spinale
   1. Liquido cerebrospinale artificiale
      nota: Il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) viene utilizzato in una camera di incubazione di interfaccia, dove le fette vengono conservate fino all'inizio della registrazione e durante gli esperimenti sia come perfusato che come diluente per i farmaci. Vedere la Tabella 1 per la composizione dettagliata.
2. Preparare un aCSF contenente (in mM) 118 NaCl, 25 NaHCO₃, 10 glucosio, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ e 2,5 CaCl₂ aggiungendo le quantità richieste di quanto sopra, escluso il CaCl₂, a 2 L di acqua distillata.
3. Far bollire la soluzione di cui sopra con carbogeno (95% O₂, 5% CO₂) per 5 minuti e aggiungere CaCl₂.
   nota: Questo passaggio impedisce la precipitazione di CaCl₂, cioè la soluzione non deve diventare torbida. Per l'applicazione del farmaco durante gli esperimenti, diluire le soluzioni madre del farmaco in aCSF alle concentrazioni finali desiderate.

2. Liquido cerebrospinale artificiale sostituito con saccarosio

NOTA: L'aCSF sostituito con saccarosio viene utilizzato durante la dissezione e il taglio del midollo spinale. Come indicato dal nome, il saccarosio viene sostituito al NaCl per ridurre l'eccitazione neuronale durante queste procedure mantenendo l'osmolarità. Vedere la Tabella 1 per la composizione dettagliata.

1. Preparare aCSF sostituito con saccarosio contenente (in mM) 250 saccarosio, 25 NaHCO₃, 10 glucosio, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ e 2,5 CaCl₂ aggiungendo le quantità richieste di tutto quanto sopra, escluso il CaCl₂, a 300 ml di acqua distillata.
2. Far bollire la soluzione con carbogeno per 5 minuti e poi aggiungere CaCl₂.
3. Conservare la soluzione in un congelatore a -80 °C per circa 40 minuti o fino a quando la soluzione non forma un impasto. Evitare il congelamento dei solidi e utilizzare in consistenza liquida.

3. Preparazione dell'array di microelettrodi

NOTA: La superficie di contatto del MEA richiede un pretrattamento per renderlo idrofilo.

1. Prima dell'esperimento, riempire il pozzetto MEA con siero fetale bovino (FBS) o siero di cavallo (HS) per 30 minuti.
2. Rimuovere l'FBS o l'HS e sciacquare accuratamente il MEA con circa cinque lavaggi di acqua distillata fino a quando l'acqua distillata non è più schiumosa. Riempire il pozzetto con aCSF, pronto per l'uso.

4. Preparazione acuta della fetta del midollo spinale

1. Anestetizzare profondamente il topo con 100 mg/kg di ketamina (i.p.) e poi decapitarlo utilizzando grandi forbici chirurgiche.
2. Rimuovere la pelle sopra la regione addominale praticando un piccolo taglio nella pelle a livello dei fianchi. Tirare la pelle su entrambi i lati del taglio rostralmente fino a rimuovere tutta la pelle, cioè dalla parte superiore della gabbia toracica alla parte superiore del bacino (sia ventralmente che dorsalmente).
3. Posiziona il corpo sul ghiaccio e usa un approccio ventrale per esporre la colonna vertebrale rimuovendo tutti i visceri e tagliando le costole lateralmente allo sterno.
4. Rimuovere la gabbia toracica ventrale, entrambe le scapole (tagliate a circa T2) e gli arti inferiori e il bacino (tagliati approssimativamente nella parte superiore dell'osso sacro).
5. Trasferire la colonna vertebrale e la preparazione delle costole in un bagno di dissezione contenente saccarosio ghiacciato aCSF. Appuntare tutti e quattro gli angoli del preparato (superficie ventrale verso l'alto) posizionando i perni attraverso i muscoli lombari e le costole superiori attaccate.
6. Rimuovere tutto il tessuto muscolare e connettivo sovrastante la superficie ventrale delle vertebre con i rongeurs e identificare la regione vertebrale sopra l'allargamento lombosacrale, che si trova approssimativamente sotto i corpi vertebrali da T12 a L2.
7. Rimuovere un corpo vertebrale che è caudale alla regione di allargamento lombosacrale per fornire l'accesso al midollo spinale mentre si trova nel canale vertebrale.
8. Usando le forbici a molla curve, taglia bilateralmente i peduncoli vertebrali mentre sollevi e tiri il corpo vertebrale rostralmente per separare gli aspetti ventrale e dorsale delle vertebre ed esporre il midollo spinale.
9. Una volta rimossi i corpi vertebrali per rivelare l'ingrossamento lombosacrale, eliminare accuratamente le radici rimanenti che ancorano il midollo spinale con le forbici a molla fino a quando il midollo non galleggia liberamente.
10. Isolare il midollo spinale con tagli rostrali e caudali ben sopra e sotto l'allargamento lombosacrale, consentendo alla regione bersaglio del midollo di "galleggiare liberamente".
    nota: L'orientamento preferito della fetta determinerà il modo in cui il cavo viene successivamente montato per il sezionamento (Figura 1).
11. Per le fette trasversali, sollevare il segmento lombosacrale da una radice attaccata e posizionarlo su un blocco di polistirene (polistirolo) pretagliato (1 cm x 1 cm x 1 cm) con un canale poco profondo tagliato al centro. Utilizzare adesivo cianoacrilato (vedere la Tabella dei materiali) per fissare il blocco e il cavo alla piattaforma di sezionamento e posizionarlo nel bagno di taglio contenente saccarosio ghiacciato aCSF (liquame).
    nota: Il canale poco profondo aiuta a fissare e orientare il midollo spinale, con il lato dorsale esposto e l'estremità toracica del midollo nella parte inferiore del blocco.
12. Per le fette sagittali, stendere una linea sottile di adesivo cianoacrilato sulla piattaforma di sezionamento, sollevare l'allargamento lombosacrale da una radice attaccata e posizionare il cavo lungo la linea di colla, assicurandosi che una superficie laterale sia nell'adesivo e l'altra rivolta verso l'alto. Metterlo nel bagno di taglio contenente saccarosio ghiacciato aCSF (liquame).
13. Per le fette orizzontali, applicare una linea sottile di adesivo cianoacrilato sulla piattaforma di sezionamento. Sollevare l'allargamento lombosacrale da una radice attaccata e posizionare l'allargamento lombosacrale lungo la linea di adesivo, assicurandosi che la superficie ventrale sia nell'adesivo e la superficie dorsale sia rivolta verso l'alto. Usa le radici attaccate per posizionare il cavo. Metterlo nel bagno di taglio contenente saccarosio ghiacciato aCSF (liquame).

5. Registrazioni di array di microelettrodi

NOTA: I seguenti passaggi descrivono in dettaglio come utilizzare i dati di registrazione da esperimenti basati su MEA su fette di midollo spinale. A seconda dell'esperimento, è possibile utilizzare diversi design MEA. I dettagli di progettazione per i MEA utilizzati in questi esperimenti sono mostrati nella Tabella 2 e nella Figura 2. Informazioni dettagliate sulla progettazione sono state pubblicate da Egert et al. e Thiebaud et al. rispettivamente per MEA planari e tridimensionali (3D). Entrambi i tipi MEA sono composti da 60 elettrodi in nitruro di titanio, con uno strato isolante in nitruro di silicio e piste e piazzole di contatto in nitruro di titanio.

1. Configurazione sperimentale
   1. Accendere il computer e la scheda di interfaccia e avviare il software di registrazione.
   2. Caricare il modello di registrazione preassemblato (Figura 3A). Assegna un nome ai file del giorno nella scheda del registratore.
   3. Bollire continuamente l'aCSF con carbogeno (5% CO₂, 95% O₂) per tutta la durata dell'esperimento.
   4. Accendere il sistema di perfusione, che è controllato da una pompa peristaltica. Posizionare la linea di ingresso in un CSF e l'estremità di ingresso in un becher di scarico. Adescare le linee di perfusione con aCSF.
   5. Preparare il 4-AP e qualsiasi altra soluzione farmacologica diluendo le scorte in 50 ml di aCSF alla concentrazione finale richiesta (ad esempio, 200 μM per il 4-AP).
2. Attività della 4-amminopiridina (4-AP)
   1. Dopo l'incubazione, trasferire una singola fetta dall'incubatrice utilizzando una pipetta Pasteur a punta larga riempita con aCSF.
   2. Metti la fetta nel pozzetto MEA e aggiungi altro aCSF.
   3. Posiziona la fetta sull'array di registrazione a 60 elettrodi usando un pennello a pelo corto fine. Evitare di entrare in contatto con gli elettrodi con il pennello o di trascinare il tessuto sugli elettrodi, soprattutto se si utilizzano array 3D.
      nota: A seconda del layout MEA, questa operazione può essere eseguita con o senza l'assistenza di un microscopio per un posizionamento accurato.
   4. Dopo aver posizionato la fetta, posizionare una rete ponderata sul tessuto per tenerlo in posizione e favorire un buon contatto con gli elettrodi MEA.
      nota: Potrebbe essere necessario riposizionare la fetta dopo il posizionamento della rete.
   5. Posizionare il MEA nell'headstage di registrazione (Figura 2A, B).
   6. Controllare la posizione del tessuto sopra gli elettrodi utilizzando un microscopio invertito (ingrandimento 2x) per confermare che il maggior numero possibile di elettrodi si trovi sotto il corno dorsale superficiale (SDH). Assicurarsi che almeno 2-6 elettrodi non entrino in contatto con la fetta, poiché questi elettrodi sono importanti per sottrarre il rumore e registrare gli artefatti durante l'analisi (Figura 2E).
   7. Accendere la fotocamera, collegarla al dispositivo e scattare un'immagine di riferimento della fetta rispetto al MEA da utilizzare durante l'analisi.
   8. Premere Start DAQ (acquisizione dati) nel software di registrazione e confermare che tutti gli elettrodi ricevano un segnale chiaro.
      nota: Se il segnale è rumoroso, sganciare l'headstage e pulire sia i cuscinetti di contatto MEA che i contatti a molla dorati con etanolo al 70% (utilizzare un panno da laboratorio per assicurarsi che i cuscinetti e i contatti siano asciutti dopo la pulizia). Se il segnale è ancora rumoroso, spegnere gli elettrodi malfunzionanti nel software di registrazione o annotare l'esclusione in un secondo momento durante l'analisi.
   9. Collegare le linee di ingresso e uscita della perfusione al pozzetto MEA (precedentemente riempito con aCSF) e accendere il sistema di perfusione. Controllare la portata, idealmente 4-6 volumi di bagno al minuto, e assicurarsi che il deflusso sia sufficiente per evitare il trabocco del superfusato.
   10. Lasciare che il tessuto si equilibri per 5 minuti, quindi registrare 5 minuti di dati di base grezzi e non filtrati.
   11. Spostare la linea di ingresso della perfusione da aCSF a una soluzione 4-AP e attendere 12 minuti affinché l'attività ritmica indotta da 4-AP raggiunga lo stato stazionario (2 minuti per i farmaci per raggiungere il bagno e 10 minuti per l'attività per raggiungere il picco e poi stabilizzarsi).
   12. Registrare 5 minuti di attività indotta da 4-AP. Preparatevi alle registrazioni successive per testare i farmaci o per verificare la stabilità del 4-AP.

Tabella 1: Composizioni del Liquido Cerebrospinale Artificiale.

Tabella 2: Layout di array di microelettrodi.

Figura 1: Orientamenti della fetta del midollo spinale, metodi di montaggio e taglio. (A) Le fette trasversali richiedono un blocco di taglio in polistirolo con una scanalatura di supporto tagliata. Il midollo spinale è appoggiato contro il blocco nella scanalatura di supporto, il lato dorsale del midollo è rivolto lontano dal blocco. Il blocco e il cavo sono incollati su una fase di taglio con adesivo cianoacrilato. (B) Le fette sagittali vengono preparate posizionando una sottile linea di adesivo cianoacrilato sulla fase di taglio e quindi posizionando il midollo spinale su un lato sulla colla. (C) Le fette orizzontali vengono preparate posizionando una linea sottile di adesivo cianoacrilato sulla fase di taglio e quindi posizionando il lato ventrale del midollo spinale rivolto verso il basso sulla colla.

Figura 2: Posizionamento del tessuto sull'array di microelettrodi. (A) L'immagine mostra un headstage MEA aperto con un MEA posizionato in posizione. (B) Come A con l'headstage MEA chiuso per le registrazioni e il sistema di perfusione tissutale in atto. (C) L'immagine mostra un MEA fornito dal produttore. Vengono mostrati i cuscinetti di contatto, che si interfacciano con le molle dorate dell'headstage, e il bagno di tessuto MEA che contiene la soluzione per il bagno di tessuto e la fetta di tessuto. L'area evidenziata dal quadrato rosso al centro è la posizione dell'array di elettrodi. (D) Gli schemi mostrano le due configurazioni di elettrodi MEA utilizzate in questo studio, con ulteriori dettagli presentati nella Tabella 2. L'elettrodo di riferimento è indicato dal trapezio blu. Il layout degli elettrodi MEA a sinistra mostra una configurazione quadrata a 60 elettrodi, utilizzata maggiormente nei modelli di lavoro presentati 60MEA200/30iR-Ti con elettrodi di diametro 30 μm distanziati di 200 μm l'uno dall'altro, o MEA tridimensionali distanziati di 200 μm e 100 μm (60MEA200/12/50iR-Ti e 60MEA100/12/40iR-Ti) con elettrodi di 12 μm di diametro e 50 μm o 40 μm di altezza, rispettivamente. Il layout dell'elettrodo MEA sinistro mostra un layout rettangolare dell'elettrodo 6 x 10-60MEA500/30iR-Ti. (E) Immagine ad alto ingrandimento di un MEA quadrato 60MEA100/12/40iR-Ti con fetta trasversale del midollo spinale posizionata per la registrazione. La fetta si trova sulle file di elettrodi 3-8. La fila superiore di elettrodi, che non entrano in contatto con alcun tessuto, funge da elettrodo di riferimento. L'area SDH appare come una banda semitrasparente. In questo caso, l'SDH si sovrappone agli elettrodi nelle righe 4, 5 e 6 e nelle colonne 2, 3, 4, 5 e 7 del MEA. Barra della scala = 200 μm. Abbreviazioni: MEA = array di microelettrodi; SDH = corno dorsale superficiale.

Figura 3: Layout degli strumenti di registrazione e analisi dei dati ed esempi di registrazioni di array di microelettrodi che mostrano il potenziale d'azione extracellulare e le forme d'onda del potenziale di campo locale. (A) Lo schema mostra il modello di registrazione preconfigurato utilizzato per l'acquisizione dei dati MEA. Il collegamento del MEA2100 e dello strumento di registrazione (headstage/amplificatore) consente di denominare e salvare i dati. Quattro tracce esemplificative di dati grezzi (a destra, epoche di 5 minuti) sono state raccolte da un canale MEA che mostrava l'attività al basale, 12 minuti dopo l'applicazione di 4-AP, altri 15 minuti dopo l'attività di 4-AP stabilita e dopo l'applicazione in bagno di TTX (1 μM). Si noti che l'aggiunta di 4-AP (seconda traccia) produce un chiaro aumento del rumore di fondo e dell'attività EAP/LFP. È importante sottolineare che l'attività rimane relativamente stabile per almeno 15 minuti dopo che l'attività indotta da 4-AP è stata stabilita (terza traccia). L'aggiunta di TTX (1 μM) abolisce tutta l'attività (traccia inferiore). (B) Lo schema (a sinistra) mostra la configurazione del software dell'analizzatore per l'analisi dei dati. Lo strumento di esplorazione dei dati grezzi viene utilizzato per importare le registrazioni raccolte dal software di registrazione. Questi dati vengono quindi fatti passare attraverso uno strumento di filtro cross-channel che sottrae i segnali degli elettrodi di riferimento selezionati dagli altri elettrodi per rimuovere il rumore di fondo. I dati passano attraverso il filtro EAP e gli strumenti di filtro LFP per ottimizzare le relazioni segnale-rumore per ciascuna forma d'onda. Al termine di questo passaggio, i dati del percorso EAP vengono inseriti nello strumento di rilevamento EAP, in cui vengono impostate le soglie. Gli EAP vengono rilevati e quindi inviati allo strumento di analisi EAP, dove le latenze di ciascun evento vengono registrate ed esportate come txt. file. Un flusso di lavoro identico si verifica per i dati LFP utilizzando un toolkit LFP corrispondente. Le tracce a destra mostrano i dati di un singolo canale MEA contenente varie forme d'onda extracellulari. La posizione dei segnali EAP e LFP è evidenziata nei "raster di conteggio" di cui sopra. Le tracce inferiori sono epoche della registrazione superiore (indicate da barre rosse) che mostrano forme d'onda su una scala temporale estesa, inclusi vari segnali LFP (notare la varietà di apparizioni) e singoli EAP extracellulari (cerchi rossi). Si noti che la forma d'onda e la polarità LFP/EAP variano in relazione al numero di neuroni che producono questi segnali, alla loro vicinanza all'elettrodo di registrazione e alla loro posizione in relazione all'elettrodo o agli elettrodi vicini. Abbreviazioni: MEA = array di microelettrodi; EAP = potenziale d'azione extracellulare; LFP = potenziale di campo locale; 4-AP = 4-amminopiridina; TTX = tetrodotossina.