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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Elettrofisiologia in vitro
- Preparazione di soluzioni per la preparazione e la registrazione di fette di midollo spinale
- Liquido cerebrospinale artificiale
nota: Il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) viene utilizzato in una camera di incubazione di interfaccia, dove le fette vengono conservate fino all'inizio della registrazione e durante gli esperimenti sia come perfusato che come diluente per i farmaci. Vedere la Tabella 1 per la composizione dettagliata.
- Preparare un aCSF contenente (in mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glucosio, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 e 2,5 CaCl2 aggiungendo le quantità richieste di quanto sopra, escluso il CaCl2, a 2 L di acqua distillata.
- Far bollire la soluzione di cui sopra con carbogeno (95% O2, 5% CO2) per 5 minuti e aggiungere CaCl2.
nota: Questo passaggio impedisce la precipitazione di CaCl2, cioè la soluzione non deve diventare torbida. Per l'applicazione del farmaco durante gli esperimenti, diluire le soluzioni madre del farmaco in aCSF alle concentrazioni finali desiderate.
2. Liquido cerebrospinale artificiale sostituito con saccarosio
NOTA: L'aCSF sostituito con saccarosio viene utilizzato durante la dissezione e il taglio del midollo spinale. Come indicato dal nome, il saccarosio viene sostituito al NaCl per ridurre l'eccitazione neuronale durante queste procedure mantenendo l'osmolarità. Vedere la Tabella 1 per la composizione dettagliata.
- Preparare aCSF sostituito con saccarosio contenente (in mM) 250 saccarosio, 25 NaHCO3, 10 glucosio, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 e 2,5 CaCl2 aggiungendo le quantità richieste di tutto quanto sopra, escluso il CaCl2, a 300 ml di acqua distillata.
- Far bollire la soluzione con carbogeno per 5 minuti e poi aggiungere CaCl2.
- Conservare la soluzione in un congelatore a -80 °C per circa 40 minuti o fino a quando la soluzione non forma un impasto. Evitare il congelamento dei solidi e utilizzare in consistenza liquida.
3. Preparazione dell'array di microelettrodi
NOTA: La superficie di contatto del MEA richiede un pretrattamento per renderlo idrofilo.
- Prima dell'esperimento, riempire il pozzetto MEA con siero fetale bovino (FBS) o siero di cavallo (HS) per 30 minuti.
- Rimuovere l'FBS o l'HS e sciacquare accuratamente il MEA con circa cinque lavaggi di acqua distillata fino a quando l'acqua distillata non è più schiumosa. Riempire il pozzetto con aCSF, pronto per l'uso.
4. Preparazione acuta della fetta del midollo spinale
- Anestetizzare profondamente il topo con 100 mg/kg di ketamina (i.p.) e poi decapitarlo utilizzando grandi forbici chirurgiche.
- Rimuovere la pelle sopra la regione addominale praticando un piccolo taglio nella pelle a livello dei fianchi. Tirare la pelle su entrambi i lati del taglio rostralmente fino a rimuovere tutta la pelle, cioè dalla parte superiore della gabbia toracica alla parte superiore del bacino (sia ventralmente che dorsalmente).
- Posiziona il corpo sul ghiaccio e usa un approccio ventrale per esporre la colonna vertebrale rimuovendo tutti i visceri e tagliando le costole lateralmente allo sterno.
- Rimuovere la gabbia toracica ventrale, entrambe le scapole (tagliate a circa T2) e gli arti inferiori e il bacino (tagliati approssimativamente nella parte superiore dell'osso sacro).
- Trasferire la colonna vertebrale e la preparazione delle costole in un bagno di dissezione contenente saccarosio ghiacciato aCSF. Appuntare tutti e quattro gli angoli del preparato (superficie ventrale verso l'alto) posizionando i perni attraverso i muscoli lombari e le costole superiori attaccate.
- Rimuovere tutto il tessuto muscolare e connettivo sovrastante la superficie ventrale delle vertebre con i rongeurs e identificare la regione vertebrale sopra l'allargamento lombosacrale, che si trova approssimativamente sotto i corpi vertebrali da T12 a L2.
- Rimuovere un corpo vertebrale che è caudale alla regione di allargamento lombosacrale per fornire l'accesso al midollo spinale mentre si trova nel canale vertebrale.
- Usando le forbici a molla curve, taglia bilateralmente i peduncoli vertebrali mentre sollevi e tiri il corpo vertebrale rostralmente per separare gli aspetti ventrale e dorsale delle vertebre ed esporre il midollo spinale.
- Una volta rimossi i corpi vertebrali per rivelare l'ingrossamento lombosacrale, eliminare accuratamente le radici rimanenti che ancorano il midollo spinale con le forbici a molla fino a quando il midollo non galleggia liberamente.
- Isolare il midollo spinale con tagli rostrali e caudali ben sopra e sotto l'allargamento lombosacrale, consentendo alla regione bersaglio del midollo di "galleggiare liberamente".
nota: L'orientamento preferito della fetta determinerà il modo in cui il cavo viene successivamente montato per il sezionamento (Figura 1).
- Per le fette trasversali, sollevare il segmento lombosacrale da una radice attaccata e posizionarlo su un blocco di polistirene (polistirolo) pretagliato (1 cm x 1 cm x 1 cm) con un canale poco profondo tagliato al centro. Utilizzare adesivo cianoacrilato (vedere la Tabella dei materiali) per fissare il blocco e il cavo alla piattaforma di sezionamento e posizionarlo nel bagno di taglio contenente saccarosio ghiacciato aCSF (liquame).
nota: Il canale poco profondo aiuta a fissare e orientare il midollo spinale, con il lato dorsale esposto e l'estremità toracica del midollo nella parte inferiore del blocco.
- Per le fette sagittali, stendere una linea sottile di adesivo cianoacrilato sulla piattaforma di sezionamento, sollevare l'allargamento lombosacrale da una radice attaccata e posizionare il cavo lungo la linea di colla, assicurandosi che una superficie laterale sia nell'adesivo e l'altra rivolta verso l'alto. Metterlo nel bagno di taglio contenente saccarosio ghiacciato aCSF (liquame).
- Per le fette orizzontali, applicare una linea sottile di adesivo cianoacrilato sulla piattaforma di sezionamento. Sollevare l'allargamento lombosacrale da una radice attaccata e posizionare l'allargamento lombosacrale lungo la linea di adesivo, assicurandosi che la superficie ventrale sia nell'adesivo e la superficie dorsale sia rivolta verso l'alto. Usa le radici attaccate per posizionare il cavo. Metterlo nel bagno di taglio contenente saccarosio ghiacciato aCSF (liquame).
5. Registrazioni di array di microelettrodi
NOTA: I seguenti passaggi descrivono in dettaglio come utilizzare i dati di registrazione da esperimenti basati su MEA su fette di midollo spinale. A seconda dell'esperimento, è possibile utilizzare diversi design MEA. I dettagli di progettazione per i MEA utilizzati in questi esperimenti sono mostrati nella Tabella 2 e nella Figura 2. Informazioni dettagliate sulla progettazione sono state pubblicate da Egert et al. e Thiebaud et al. rispettivamente per MEA planari e tridimensionali (3D). Entrambi i tipi MEA sono composti da 60 elettrodi in nitruro di titanio, con uno strato isolante in nitruro di silicio e piste e piazzole di contatto in nitruro di titanio.
- Configurazione sperimentale
- Accendere il computer e la scheda di interfaccia e avviare il software di registrazione.
- Caricare il modello di registrazione preassemblato (Figura 3A). Assegna un nome ai file del giorno nella scheda del registratore.
- Bollire continuamente l'aCSF con carbogeno (5% CO2, 95% O2) per tutta la durata dell'esperimento.
- Accendere il sistema di perfusione, che è controllato da una pompa peristaltica. Posizionare la linea di ingresso in un CSF e l'estremità di ingresso in un becher di scarico. Adescare le linee di perfusione con aCSF.
- Preparare il 4-AP e qualsiasi altra soluzione farmacologica diluendo le scorte in 50 ml di aCSF alla concentrazione finale richiesta (ad esempio, 200 μM per il 4-AP).
- Attività della 4-amminopiridina (4-AP)
- Dopo l'incubazione, trasferire una singola fetta dall'incubatrice utilizzando una pipetta Pasteur a punta larga riempita con aCSF.
- Metti la fetta nel pozzetto MEA e aggiungi altro aCSF.
- Posiziona la fetta sull'array di registrazione a 60 elettrodi usando un pennello a pelo corto fine. Evitare di entrare in contatto con gli elettrodi con il pennello o di trascinare il tessuto sugli elettrodi, soprattutto se si utilizzano array 3D.
nota: A seconda del layout MEA, questa operazione può essere eseguita con o senza l'assistenza di un microscopio per un posizionamento accurato.
- Dopo aver posizionato la fetta, posizionare una rete ponderata sul tessuto per tenerlo in posizione e favorire un buon contatto con gli elettrodi MEA.
nota: Potrebbe essere necessario riposizionare la fetta dopo il posizionamento della rete.
- Posizionare il MEA nell'headstage di registrazione (Figura 2A, B).
- Controllare la posizione del tessuto sopra gli elettrodi utilizzando un microscopio invertito (ingrandimento 2x) per confermare che il maggior numero possibile di elettrodi si trovi sotto il corno dorsale superficiale (SDH). Assicurarsi che almeno 2-6 elettrodi non entrino in contatto con la fetta, poiché questi elettrodi sono importanti per sottrarre il rumore e registrare gli artefatti durante l'analisi (Figura 2E).
- Accendere la fotocamera, collegarla al dispositivo e scattare un'immagine di riferimento della fetta rispetto al MEA da utilizzare durante l'analisi.
- Premere Start DAQ (acquisizione dati) nel software di registrazione e confermare che tutti gli elettrodi ricevano un segnale chiaro.
nota: Se il segnale è rumoroso, sganciare l'headstage e pulire sia i cuscinetti di contatto MEA che i contatti a molla dorati con etanolo al 70% (utilizzare un panno da laboratorio per assicurarsi che i cuscinetti e i contatti siano asciutti dopo la pulizia). Se il segnale è ancora rumoroso, spegnere gli elettrodi malfunzionanti nel software di registrazione o annotare l'esclusione in un secondo momento durante l'analisi.
- Collegare le linee di ingresso e uscita della perfusione al pozzetto MEA (precedentemente riempito con aCSF) e accendere il sistema di perfusione. Controllare la portata, idealmente 4-6 volumi di bagno al minuto, e assicurarsi che il deflusso sia sufficiente per evitare il trabocco del superfusato.
- Lasciare che il tessuto si equilibri per 5 minuti, quindi registrare 5 minuti di dati di base grezzi e non filtrati.
- Spostare la linea di ingresso della perfusione da aCSF a una soluzione 4-AP e attendere 12 minuti affinché l'attività ritmica indotta da 4-AP raggiunga lo stato stazionario (2 minuti per i farmaci per raggiungere il bagno e 10 minuti per l'attività per raggiungere il picco e poi stabilizzarsi).
- Registrare 5 minuti di attività indotta da 4-AP. Preparatevi alle registrazioni successive per testare i farmaci o per verificare la stabilità del 4-AP.
Tabella 1: Composizioni del Liquido Cerebrospinale Artificiale.
| chimico | aCSF (mM) | aCSF (g/100 mL) | ACSF sostituito con saccarosio (mM) | ACSF sostituito con saccarosio (g/100 mL) | ACSF ad alto contenuto di potassio (mM) | ACSF ad alto contenuto di potassio (g/100 mL) |
| Cloruro di sodio (NaCl) | 118 | 0,690 | - | - | 118 | 0,690 |
| Carbonato acido di sodio (NaHCO3) | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 |
| glucosio | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 |
| Cloruro di potassio (KCl) | 2.5 | 0,019 | 2.5 | 0,019 | 4.5 | 0,034 |
| Diidrogeno fosfato di sodio (NaH2PO4) | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 |
| Cloruro di magnesio (MgCl2) | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 |
| Cloruro di calcio (CaCl2) | 2.5 | 0,028 | 2.5 | 0,028 | 2.5 | 0,028 |
| saccarosio | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tabella 2: Layout di array di microelettrodi.
| Layout dell'array di microelettrodi |
| Modello di array di microelettrodi | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Planare o tridimensionale (3D) | planare | 3d | 3d | planare |
| Griglia di elettrodi | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 6 x 10 |
| Spaziatura degli elettrodi | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Diametro dell'elettrodo | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Altezza elettrodo (3D) | N/A | 40 μm | 50 μm | N/A |
| Esperimenti | Sezione trasversale | Sezione trasversale | Sagittale + Orizzontale | Sagittale + Orizzontale |
