Registrazione dei cambiamenti nell'attività del nervo simpatico renale in risposta alla pressione arteriosa nei ratti

Abstract

Fonte: Fink, A. M., et al. Quantificazione dei cambiamenti acuti nell'attività del nervo simpatico renale in risposta alle manipolazioni del sistema nervoso centrale nei ratti anestetizzati. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra una tecnica di studio dell'attività dei nervi simpatici renali (RSN) in risposta ai cambiamenti della pressione arteriosa nei ratti. Dopo aver collegato un catetere sensibile alla pressione all'arteria femorale, i nervi simpatici renali vengono esposti. I nervi vengono quindi sollevati su un elettrodo di registrazione e la loro attività elettrica viene registrata. Successivamente, viene iniettato un farmaco vasocostrittore per aumentare la pressione sanguigna e vengono monitorati i corrispondenti cambiamenti nell'attività dell'RSN.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Crea Elettrodi RSNA Bipolari

1. Per creare l'elettrodo, tagliare due pezzi di filo di acciaio inossidabile lunghi circa 18 mm ciascuno. Tagliare un pezzo di tubo in polietilene (PE-50) lungo circa 15 mm. Inserire entrambi i pezzi di filo nel tubo, lasciando il filo che sporge da entrambe le estremità.
2. Rimuovere l'isolamento dalle estremità dei fili; tagliare i fili lasciando 2-3 mm di filo scoperto. Su un'estremità, crimpare i pin maschio sul filo esposto. Saldare saldamente i pin al filo, fissare i pin all'interno di una striscia di connettori e coprire la connessione con resina epossidica.
   nota: Un approccio alternativo che evita la saldatura consiste nell'utilizzare clip a coccodrillo a connessione/sgancio rapido.
3. All'estremità opposta dell'elettrodo, rimuovere l'isolamento dalle estremità dei fili, lasciando 2-3 mm di filo scoperto. Piega questa parte dei fili per creare piccoli ganci a forma di "V" nel filo non isolato.
   nota: Questa è la porzione dell'elettrodo che sarà a contatto con il nervo simpatico renale. È importante sigillare questa estremità per evitare che i fluidi entrino nel tubo. Il silicone o la resina epossidica possono essere utilizzati in modo efficace.

2. Somministrare l'anestesia e preparare i siti chirurgici

1. Somministrare l'anestesia a un ratto maschio di Sprague Dawley (età 9-11 settimane, peso 150-400 g). Somministrare pentobarbital sodico 50 mg/kg tramite iniezione intraperitoneale (IP). Per valutare un piano stabile di anestesia durante l'intervento chirurgico, controllare il riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi ogni 15 minuti e dosare nuovamente l'anestesia secondo necessità.
   nota: Il pentobarbital sodico (Nembutal) è stato utilizzato in studi precedenti per ottenere un piano di anestesia sostenuto senza interferire con la modulazione dell'RSNA. Questo protocollo è per la chirurgia non di sopravvivenza, quindi non c'è un periodo di recupero/monitoraggio post-operatorio.
2. Preparare il sito chirurgico secondo le linee guida istituzionali per la cura degli animali (ad esempio, radere l'addome, la schiena e la testa del ratto; pulire la pelle con una soluzione di iodio povidone al 10%; applicare lubrificante per gli occhi e posizionare il ratto su un termoforo). Mantenere la temperatura corporea a 37 °C durante gli esperimenti.

3. Incannulare l'arteria femorale per il monitoraggio della pressione arteriosa media

1. Visualizza l'arteria al microscopio. Simile al metodo utilizzato per l'incannulamento venoso, legare la sutura distale per occludere l'arteria; Fissare i bordi di questa sutura al campo chirurgico con nastro di seta e posizionare l'arteria perpendicolarmente alla mano dominante del chirurgo.
2. Accesso arterioso se si utilizza la telemetria
   1. Ispezionare il catetere sensibile alla pressione ad alto ingrandimento prima dell'incannulamento arterioso. Assicurarsi che il catetere sia privo di bolle/detriti e che abbia un menisco intatto tra i componenti pieni di liquido (prossimali) e quelli pieni di gel (distali). Prima di ogni impianto, riempire nuovamente il gel sulla punta distale del catetere. Accendere il trasmettitore utilizzando un magnete; monitorare la pressione sanguigna (BP) durante l'intervento chirurgico per sopportare un posizionamento perfetto.
   2. Utilizzare un mezzo nodo allentato nella sutura prossimale per occludere brevemente l'arteria femorale. Tenere l'introduttore del catetere nella mano non dominante. Tenere la punta della cannula dell'unità di telemetria con una pinza per l'incannulamento dei vasi per evitare di spostare il gel dalla punta.
   3. Praticare un foro nell'arteria con l'ago 22G piegato e inserire la cannula nell'arteria utilizzando una pinza per incannulamento dei vasi per evitare di spostare il gel dalla punta. Far avanzare la cannula il più possibile. Utilizzando le fascette di sutura prossimale e distale, fissare il catetere a pressione.
   4. Infilare il corpo dell'impianto telemetrico all'interno del fianco adiacente all'incisione e chiudere questa incisione utilizzando una sutura di nylon 4-0 su un ago da taglio. Spegnere i dispositivi di telemetria tramite magnete al termine del periodo di registrazione per preservare la durata della batteria.

4. Posiziona il ratto nel telaio della chirurgia stereotassica per accedere al cervello

1. Spostare delicatamente il ratto in posizione prona nel telaio della chirurgia stereotassica.
2. Posiziona il ratto tra le barre auricolari e regola la barra incisiva per equalizzare l'altezza di lambda e bregma. Il posizionamento può dipendere dal ceppo del ratto, dal peso e dalla posizione dei bersagli del sistema nervoso centrale (SNC).
3. Praticare un'incisione di 2 cm con il bisturi rostrocaudale attraverso la linea mediana del cuoio capelluto. Utilizzando applicatori con punta di cotone, rimuovere saldamente il tessuto connettivo dalla superficie del cranio. Applicare perossido di idrogeno al cranio per facilitare la visualizzazione delle suture bregma, lambda e della linea mediana.
4. Utilizzando un atlante del cervello di ratto per guidare il targeting, praticare un'osteotomia con foro di bava, dimensionato per l'accesso agli elettrodi, attraverso il cranio.

5. Isolare i nervi simpatici renali

1. Collegare l'elettrodo RSNA a filo (passaggi 1.1-1.3) a un preamplificatore 10X e a un amplificatore per microelettrodi.
2. Isolare i nervi renali attraverso un'incisione retroperitoneale prima o dopo che il ratto è fissato nel telaio stereotassico. Posizionare gli elettrodi RSNA una volta che il ratto si trova nel frame stereotassico. Praticare un'incisione con il bisturi che si estende da 4-5 cm sotto le costole in direzione caudale, leggermente lateralmente alla colonna vertebrale. Blunt seziona l'incisione per visualizzare i muscoli paraspinali.
3. Usa le forbici per praticare un'incisione rostrocaudale molto superficiale di 1-2 cm dove il grasso incontra il muscolo. Usando applicatori con punta di cotone, distribuisci il grasso lontano dal muscolo per visualizzare il rene. È importante non entrare nello spazio peritoneale.
4. Utilizzare i divaricatori per separare delicatamente il rene dai muscoli paraspinali per visualizzare l'arteria renale e l'aorta addominale. Non allungare eccessivamente i vasi per evitare di danneggiare i nervi renali. Utilizzare una garza di cotone da 2 "x 2" imbevuta di soluzione salina per proteggere il rene da lesioni.
5. Ad alto ingrandimento, identificare i nervi renali nella tasca dell'incisione. I fasci nervosi sono più facilmente visibili nell'angolo retto formato dall'aorta e dall'arteria renale. I nervi renali seguono da vicino l'arteria renale dall'aorta ai reni.
6. Selezionare un segmento del fascio nervoso che verrà posizionato sull'elettrodo di registrazione. Sezionare delicatamente le fibre nervose dal tessuto/vaso circostante utilizzando una pinzetta per microdissezione.
7. Fissare l'elettrodo RSNA in un supporto (ad es. una clip a coccodrillo fissata a un supporto di supporto). Abbassare l'elettrodo al livello del segmento nervoso. Utilizzare un gancio nervoso per sollevare delicatamente il segmento del nervo renale sull'elettrodo senza allungare il nervo.
   nota: Il nervo dovrebbe riposare all'interno di entrambi i ganci a forma di "V" nel filo non isolato, parallelamente al nervo. I fili degli elettrodi non devono toccare altri tessuti, sangue o fluido linfatico.
8. Riempire l'incisione con olio minerale per evitare che il nervo simpatico renale esposto si secchi. Utilizzare una clip di messa a terra con un'estremità sulla pelle dell'incisione e l'altra attaccata alla gabbia di Faraday.
9. Dirigere il segnale verso gli amplificatori utilizzando il filtraggio passa-alto e passa-basso (10 Hz e 3 kHz). Regolare il guadagno fino a 10 K. Includere un monitor audio per valutare il modello di bursting dell'RSNA. Utilizzare frequenze di campionamento comprese tra 2.000 e 10.000 Hz. Utilizzare una frequenza di campionamento aumentata quando si ipotizza che una manipolazione del SNC causi risposte simpatiche rapide/brevi.

6. Registra i dati

1. Valutare la qualità della registrazione RSNA evocando il baroreflex con un'iniezione in bolo di 1 mL di soluzione fisiologica o 10 μg/mL di fenilefrina (in 0,1 mL) per via endovenosa. Come illustrato nella Figura 1, l'infusione dovrebbe aumentare la pressione arteriosa e inibire l'RSNA. Un aumento della pressione arteriosa media di 60-80 mmHg è sufficiente per l'inibizione della simpatia renale.
2. Regolare la posizione degli elettrodi per migliorare il segnale, se necessario. Il riposizionamento è necessario se il nervo non è a contatto con entrambi i ganci dell'elettrodo o se qualsiasi tessuto, sangue o fluido linfatico è a contatto con i fili.
   nota: La necessità di riposizionamento si basa sulle caratteristiche uditive delle scariche nervose.
3. Una volta ottenuto un segnale chiaro, fissare l'elettrodo RSNA in posizione prelevando l'olio minerale e applicando un gel di silice per coprire la connessione nervo/elettrodo nella tasca dell'incisione. Non spostare il ratto prima che il gel si sia completamente solidificato.
4. Eseguire protocolli di manipolazione del SNC registrando continuamente l'RSNA e la pressione arteriosa media. Se un microiniettore/pulsatore viene utilizzato per le manipolazioni del tronco encefalico, un segnale logico da questo dispositivo può essere introdotto nelle registrazioni RSNA/BP per documentare la tempistica delle manipolazioni del SNC.
5. Al termine dell'esperimento, determinare il livello di rumore schiacciando il nervo prossimale agli elettrodi di registrazione tra il gel di silice e il muscolo spinale. Registrare almeno 30 s di questo valore "zero" per RSNA. Come approccio alternativo per quantificare il rumore, somministrare un bloccante gangliare a breve durata d'azione come atropina, esametonio, clorisondamina o pentolinium tartrato.
6. Rimuovere con cautela l'elettrodo RSNA e rimuovere eventuali tracce di gel di silice dagli elettrodi a filo. Conservare l'elettrodo per riutilizzarlo. Spegnere il trasmettitore di telemetria e rimuoverlo, facendo attenzione a non danneggiare la punta del catetere.

Risultati

Figura 1: RSNA e BP in risposta all'iniezione di fenilefrina IV.L'RSNA grezzo (A) è stato rettificato a onda intera (B); l'RSNA frantumato rettificato è mostrato nel riquadro C. Sono state calcolate medie di 10 s non sovrapposte (meno rumore) (D). Per evocare il baroriflesso, 0,1 mL di fenilefrina (1 μg/mL) sono stati iniettati per v...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filo di acciaio inossidabile	Sistemi A-M; Sequim, WA	Codice 791000	Elettrodo RSNA
Tubo in polietilene (PE-50)	VWR; Radnor, Pennsylvania	Codice 63019-048	Elettrodo RSNA; incannulamento dei vasi
Connettore pin miniaturizzato	Sistemi A-M; Sequim, WA	Codice: 520200	Elettrodo RSNA
Pinza a crimpare	Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, Florida	Codice: M22520	Elettrodo RSNA
Striscia di connessione	Amphenol; Clinton Township, MI	Codice 221-2653	Elettrodo RSNA
J-B Kwik Epossidico	J-B Weld, molle di zolfo, TX	Codice: 8270	Elettrodo RSNA
silicone	Permatex; Hartford, CT	Codice: 2222	Elettrodo RSNA
Eparina sodica; Iniettabile (flaconcino da 10 mL, 1000 U/mL)	Forniture veterinarie KV; David City, NE	P03466	Pervietà della linea venosa
Fenilefrina HCl; Iniettabile (flaconcino da 1 mL; 10 mg/mL)	Fornitura chirurgica ACE; Brockton, MA	950-6312	Test della simpatimetria renale
Stecche chirurgiche elastiche a gancio singolo	Apparato di Harvard; Holliston, MA	72-2595	incisione
Nastro chirurgico in seta	3M, Minneapolis, MN	Codice: 1538-0	Soggiorni chirurgici sicuri
Aghi, 20 g	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	Z192554-100EA	Incannulamento dei vasi
Pinza curva Dumont #7	Strumenti di Fine Science; Città di Foster (California)	Codice 11274-20	Incannulamento dei vasi
5-0 lacci di sutura in seta	Braintree Scientifico; Braintree, MA	SUT-S 106	Incannulamento dei vasi
Delicata pinza emostatica	Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD	RS-7117	Incannulamento dei vasi e chirurgia RSNA
Pinze emostatiche Crile	Strumenti di Fine Science; Città di Foster (California)	Codice: 13004-14	Piegatura dell'ago
Trasmettitore di telemetria	Scienze dei dati internazionali; Minneapolis, MN	PA-10	Monitoraggio della pressione arteriosa media (telemetria)
Siringa di re-gel	Scienze dei dati internazionali; Minneapolis, MN	Codice 276-0038-001	Riutilizzo del trasmettitore (telemetria)
Trasduttore di pressione monouso	Transpac; San Clemente, CA	MI-1224	Monitoraggio della pressione arteriosa media
Infusore a pressione Clear-Cuff	MILA Internazionale Inc.; Firenze, Kentucky	2281339	Monitoraggio della pressione arteriosa media
Pinze per incannulamento dei vasi	Strumenti di Fine Science; Città di Foster (California)	Codice 00574-11	Inserimento del catetere
Sutura in nylon 4-0 monofilamento nero su ago da taglio inverso	McKesson Medico-Chirurgico; San Francisco, California	S661GX	Trasmettitore di telemetria sicuro
Ricevitore di telemetria	Scienze dei dati internazionali; Minneapolis, MN	RPC-1	Monitoraggio della pressione arteriosa media (telemetria)
LabChart Pro (software), PowerLab (hardware di acquisizione)	Strumenti AD; Colorado Springs, CO	ML846, matrice MX2 2.0 (compatibile con la telemetria di Data Science International)	3 opzioni per software/hardware di acquisizione
SciWorks (software), DataWave (hardware di acquisizione)	DataWave Technologies, Loveland, CO	N/A
Spike 2 (software), Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd., Londra Regno Unito	Codice: 1401-3
Micro-trapano	Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD	RS-6300	Chirurgia del SNC
Telaio per chirurgia stereotassica	Stoelting; Wood Dale, IL	Codice: 51600	Chirurgia del SNC
Amplificatore a microelettrodi con preamplificatore 10X	Sistemi A-M; Sequim, WA	Anno 1800-2	Registrazione RSNA
Divaricatori	Strumenti di Fine Science; Città di Foster (California)	Codice: 17009-07	Registrazione RSNA
Pinzette per micro-dissezione	Strumenti di Fine Science; Città di Foster (California)	Codice 11251-10	Registrazione RSNA
Micro-gancio	Strumenti di Fine Science; Città di Foster (California)	Codice 10064-14	Registrazione RSNA
olio minerale	Fisher Scientifico; Waltham, MA	8042-47-5	Registrazione RSNA
Monitor audio	Sistemi A-M; Sequim, WA	3300	Registrazione RSNA
Gel di silice	Wacker, Monaco; Germania	RT601A-B	Registrazione RSNA
Clip elettriche	Tyco Elettronica; Sciaffusa, Svizzera	EB0283-000	Messa a terra o fissaggio dell'ago di perfusione
Forbici Bonn, punte diritte/affilate	Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD	RS-5840	perfusione
Ago per sonda gastrica	Apparato di Harvard; Holliston, MA	75-0286	perfusione
Pompa di perfusione Masterflex	Cole-Parmer; Vernon Hills, Illinois	Codice: 7524-10	perfusione
Tubo in silicone Masterflex platinicato	Cole-Parmer; Vernon Hills, Illinois	Codice 96410-15	perfusione
Formalina (soluzione tamponata al 10%; 4 L)	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	HT501128	perfusione
saccarosio	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	S0389	Crioprotezione