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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Registrazioni di patch-clamp a cellula intera
- Trasferire la prima sezione di tessuto nella camera di registrazione immersa in un flusso continuo di soluzione di Krebs. Montare la sezione utilizzando pesi leggeri e immergere l'obiettivo.
- Identificare la regione striatale al microscopio e cercare i neuroni GFP-positivi (riprogrammati). Seleziona un neurone che abbia una morfologia estesa e non coperto da fasci di fibre o vasi sanguigni.
- Preparare le pipette in vetro borosilicato (3-7 MΩ) per il patching e riempirle con la seguente soluzione intracellulare (in mM): 122,5 gluconato di potassio, 12,5 KCl, 0,2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0,3 Na3GTP e 8 NaCl, regolate a pH 7,3 con KOH.
- Collegare la pipetta di vetro all'elettrodo di registrazione e immergerla nella soluzione. Ricontrollare la resistenza dell'elettrodo. Quindi, avvicinarsi lentamente alla cella con la pipetta, mantenendo una leggera pressione positiva sull'elettrodo per evitare di ostruire la punta.
cautela: Fare attenzione a tenere traccia della cella mentre si scende l'elettrodo e a non sbiancare la fluorescenza nella cella (ad esempio, spegnere la lampada a fluorescenza quando non è necessaria).
- Sciacquare accuratamente il tessuto circostante utilizzando la pressione positiva dell'elettrodo e avvicinarsi alla cella con l'elettrodo. Posizionare l'elettrodo proprio sopra la cella e scendere fino a quando l'elettrodo non ha toccato la membrana. Realizzare una sigillatura Giga-Ω tra l'elettrodo e la membrana cellulare e, con impulsi di pressione negativa, rompere la membrana per creare un cerotto a cellula intera><.
cautela: I neuroni riprogrammati sono sensibili. Prestare attenzione durante l'applicazione dei cerotti e non esercitare troppa pressione negativa quando si raggiunge una tenuta Giga-Ω o si apre la membrana cellulare. Inoltre, il cerotto sugli animali più anziani richiede pratica e pazienza poiché il loro tessuto connettivo è più spesso ed è più difficile visualizzare i neuroni.
- Controllare i potenziali di membrana a riposo subito dopo il rodaggio in modalità current-clamp e annotarli per l'analisi.
- Nella pinza amperometrica, mantenere la cella tra -60 mV e -80 mV e iniettare correnti di 500 ms da -20 pA a +90 pA, con incrementi di 10 pA per indurre potenziali d'azione.