Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparare l'animale per l'imaging
- Posizionare garze sterili, tamponi di cotone e strumenti chirurgici autoclavati nell'area chirurgica. Accendi un Micro Beader Sterilizer per la sterilizzazione interchirurgica degli strumenti chirurgici.
- Anestetizzare il topo (maschio o femmina, 1,5-2,5 mesi, 20-25 g) mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (17,2 mg/mL), xilazina (0,475 mg/mL) e acepromazina (0,238 mg/mL) (6 μL/g di peso corporeo). Attendere fino a quando non viene raggiunta la corretta profondità di anestesia quando l'animale smette di rispondere a uno stimolo di pizzicamento delle dita dei piedi e non ha riflesso corneale. Durante l'intervento chirurgico, somministrare una dose di richiamo pari a 1/3 della dose originale del cocktail anestetico secondo necessità per mantenere lo stato anestetico originale.
- Iniettare buprenorfina per via sottocutanea (s.c.; 0,05-0,10 mg/kg) come agente analgesico prima dell'intervento chirurgico. Applicare un unguento protettivo sugli occhi dell'animale per prevenire l'essiccazione corneale e la formazione di cataratta.
- Posiziona un mouse transgenico GCaMP6s su un termoforo per prevenire l'ipotermia e coprilo con un telo chirurgico sterile. Stabilizza la testa dell'animale con un adattatore per la testa per topi.
- Radere la testa sulla maggior parte del cuoio capelluto con una lama di rasoio a doppio taglio. Pulire l'area chirurgica con un tampone sterile per la preparazione di alcol, seguito da una soluzione di iodio povidone.
2. Preparazione cronica della finestra cranica
- Fai un taglio rettangolare del cuoio capelluto (2 mm x 3 mm) con un paio di forbici su un lato (a destra) del cranio. Spingere da parte la pelle con un batuffolo di cotone per creare un'area di esposizione di >3 mm di diametro (Figura 1A). Rimuovere il tessuto connettivo attaccato al cranio raschiando delicatamente il cranio con una lama microchirurgica smussata (Scalpel Blade #10; Figura 1C).
- Segna l'area S1 disegnando delicatamente un cerchio (3 mm di diametro, coordinazione centrale: -1,5 mm dalla bregma e 2,5 mm dalla linea mediana) sul cranio usando un trapano dentale (Figura 2B).
- Eseguire la stessa procedura sul cranio sinistro (Figura 2B).
- Applicare uno strato sottile di cianoacrilato Super Glue sull'osso per fornire una base per l'applicazione del cemento dentale.
- Sotto un microscopio da dissezione, assottigliare un solco circolare nel cranio attorno all'area S1 utilizzando un microtrapano ad alta velocità (Figura 1D). Lo scopo è quello di creare un bordo liscio per il posizionamento di una finestra ottica su di esso.
- Applicare ripetutamente liquido cerebrospinale artificiale (ACSF, temperatura ambiente) al cranio periodicamente durante il processo di assottigliamento per facilitare la perforazione e dissipare il calore. Eseguire la foratura in modo intermittente per evitare il surriscaldamento indotto dall'attrito. Aspirare i detriti ossei con una linea di aspirazione domestica o una pompa a vuoto.
- Dopo aver perforato circa 2/3 della profondità dell'osso, assottigliare lentamente e con attenzione il restante 1/3 dell'osso fino a quando un pezzo circolare del cranio (lembo osseo) è completamente libero dal cranio circostante.
- Rimuovere lentamente e con attenzione il lembo osseo circolare con un paio di pinze # 5/45 ed esporre la dura madre (Figura 2C; Figura 1E).
- Mantenere umida la regione cerebrale esposta con ACSF (Figura 1E). Evita qualsiasi danno ai vasi piali poiché l'emorragia altera il flusso sanguigno cerebrale, accelera il gonfiore cerebrale e degrada gravemente la qualità dell'imaging.
- Eseguire la stessa procedura sul lato sinistro (controlaterale) del cranio.
- Per assemblare la finestra ottica, utilizzare un adesivo ottico per incollare e polimerizzare uno alla volta tra gli strati di vetro di copertura. Se necessario, riscaldare la finestra ottica (50 °C per 12 ore) in un'incubatrice per migliorare l'incollaggio. La finestra ottica è composta da 2 porzioni: la parte superiore contiene un singolo vetro di copertura rotondo con un diametro di 5 mm e la parte inferiore contiene 1-3 vetri di copertura rotondi con un diametro di 3 mm (Figura 2D).
- Conservare la finestra ottica in etanolo (70%, vol/vol) e sciacquarla con soluzione fisiologica sterile prima dell'uso. Prima dell'installazione della finestra ottica, controllare che la finestra ottica non presenti imperfezioni, tra cui una quantità errata di adesivo ottico o un allineamento impreciso sotto uno stereoscopio.
- Installare la finestra ottica sulla regione della craniotomia (Figura 2D). La parte superiore della finestra ottica poggia sul cranio e la parte inferiore della finestra ottica si inserisce all'interno dell'apertura craniotomizzata e poggia sulla dura madre in presenza di liquido cerebrospinale (Figura 2D, E).
- Sigillare la parte superiore del bordo della finestra ottica al cranio con la super colla cianoacrilica (Figura 2F; Figura 1F).
- Quando la Super Colla Cianoacrilica si è asciugata, applicare del cemento dentale nero (Dentsply) per coprire il bordo del vetro. Applicare il cemento dentale su tutto il cranio esposto e sui margini della ferita per bloccare la luce (Figura 2G-H; Figura 1B).
- Eseguire la stessa procedura sul lato sinistro.
- Lasciare che l'animale si riprenda sul termoforo e riportare l'animale nella gabbia di casa per il recupero sotto un adeguato monitoraggio. Fornire cibo umido per facilitare la masticazione e l'idratazione. Per ridurre il dolore, somministrare buprenorfina s.c. (0,05-2,0 mg/kg) ogni 8-12 ore dopo l'infortunio per 2 giorni. Lasciare che il mouse si riprenda per altri 7-10 giorni prima dell'imaging.
