Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di tubi, elettrodi e strumenti per la procedura chirurgica
- Utilizzare i seguenti strumenti microchirurgici: forbici chirurgiche, micro forbici angolate, pinze per tessuti, un paio di micro pinze curve Dumont #7 e #5, un micro portaaghi e divaricatori.
nota: Si tratta di una procedura acuta, quindi non è necessario sterilizzare gli strumenti. Dopo l'uso, pulire e strofinare le punte con etanolo al 70%.
- Immergere il tubo in etanolo al 70% e quindi sciacquarlo con NaCl sterile allo 0,9% con 100 U/mL di eparina prima dell'uso. Lasciare il tubo pieno per evitare di introdurre bolle d'aria nel sistema.
- Tagliare un pezzo di tubo di polietilene (PE)-50 di 20-30 cm per realizzare un catetere per la misurazione della pressione intracavernosa (ICP). Assicurarsi che il tubo sia il più corto possibile per ridurre lo smorzamento della pressione.
- Piega un ago sterile da 24 G da un lato all'altro finché l'ago non si rompe al centro. Collegare il pezzo con lo smusso all'estremità distale del tubo in PE per l'inserimento nella crus del pene. Inserire l'altra metà nel mozzo per il collegamento al trasduttore di pressione. Riempire il sistema con soluzione fisiologica eparinizzata (100 U/mL).
- Per realizzare l'elettrodo bipolare rivestito in teflon, tagliare due fili d'argento da 125 μm della stessa lunghezza. Usa un pezzo di nastro adesivo per fissare i fili al bordo del tavolo e infilali insieme. Quindi, collegare l'elettrodo a una piastra nera.
- Praticare una piccola incisione nel teflon e utilizzare una micro pinza #5 per rimuovere una lunghezza di 4-5 mm di rivestimento in teflon dalle punte degli elettrodi. Taglia le punte con un bisturi per ottenere una lunghezza uniforme e crea ganci piegando le estremità attorno al bordo smussato della lama di un bisturi.
- Fissare l'elettrodo con l'estremità che si estende leggermente oltre il bordo della piastra nera con i ganci rivolti verso l'alto. Mescolare la colla siliconica su una piastra di plastica per 10 s e avvolgere una bolla di colla attorno all'elettrodo a 1-2 mm dal gancio.
- Lasciarlo asciugare per circa 5 minuti prima dell'uso (Figura 1). Spelare il teflon da una sezione più lunga sull'altra estremità per consentire il collegamento allo stimolatore.
nota: Quando si rifanno i ganci sull'estremità distale, l'elettrodo può essere riutilizzato molte volte.
2. Preparazione dell'animale
- Dopo aver anestetizzato l'animale, radere la metà inferiore dell'addome, del collo e del perineo. Strofinare l'animale con alcol al 70% seguito da iodio povidone tre volte. Posizionare il ratto su un cuscinetto chirurgico riscaldato in posizione supina. Applicare l'unguento veterinario e passare l'anestesia a un cono nasale con isoflurano al 2,5% e 0,8 L/min di ossigeno come vettore.
nota: Regolare il livello di isoflurano e ossigeno per raggiungere un livello accettabile di anestesia.
3. Preparazione prechirurgica
- Eseguire l'intera procedura chirurgica al microscopio operatorio: è sufficiente un ingrandimento che va da 3,15X a 20X. Utilizzare i guanti e mantenere un ambiente pulito durante l'intervento. Metti il topo su un drappo.
4. Dissezione del muscolo ischiocavernoso per la misurazione ICP
- Utilizzare un bisturi, forbici dritte e micro pinze curve Dumont #7 per praticare un'incisione cutanea verticale di 1 cm 5 mm lateralmente alla linea mediana che inizia a livello della base del pene e si estende verso il basso (Figura 2A). Utilizzare un cotton fioc e separare con cura la fascia lateralmente allo scroto (Figura 2B). Dopo aver sezionato la fascia, attaccare i divaricatori e palpare con uno swap con la punta di cotone per trovare la tuberosità ischiatica (Figura 2C).
- Sezionare il tessuto adiposo mediale di questo punto fino a visualizzare il muscolo ischiocavernoso (Figura 3A). Utilizzare un paio di micro pinze curve Dumont #7 e separare longitudinalmente il muscolo. La tunica albuginea apparirà come una struttura bianca brillante (Figura 3B). Utilizzando una micro pinza e una micro forbice, esporre adeguatamente la tunica albuginea per vederne il decorso (Figura 3C).
- Dopo la calibrazione delle impostazioni del sistema, inserire il tubo attraverso la pelle del perineo, assicurandosi che scorra parallelo alla crus del pene (Figura 4). Lasciare la linea in posizione e mantenere l'incisione umida con soluzione fisiologica.
5. Dissezione CN per stimolazione
- Praticare un'incisione addominale più bassa di 2 cm attraverso la pelle utilizzando prima un bisturi e poi un paio di forbici dritte e micro pinze. Crea un'incisione corrispondente attraverso la fascia lungo la linea alba e il tessuto muscolare sottostante per esporre la vescica e la prostata.
- Utilizzare i divaricatori per ottenere una buona esposizione. Utilizzare tamponi con punta di cotone per separare la prostata dal tessuto adiposo per ottenere una chiara visualizzazione del ganglio pelvico maggiore (MPG) e del nervo cavernoso (CN), che corrono sulla faccia dorsolaterale della prostata (Figura 5).
- Dopo la visualizzazione dell'MPG e del CN, incidere con cura la fascia sovrastante il nervo di 2-5 mm distalmente all'MPG con micro forbici angolate (Figura 6a). Con l'uso di micro pinze #5, stendere il tessuto su ciascun lato del nervo e sotto di esso per liberare una porzione lunga 4 mm (Figura 6b) e far scorrere una sutura 9-0 sotto il nervo (Figura 6c).
- Sollevare leggermente il nervo con l'aiuto della sutura (Figura 7a) per facilitare il posizionamento dei ganci dell'elettrodo bipolare attorno al nervo (Figura 7b). Lascia che un assistente mescoli la colla siliconica bicomponente con la punta di un ago da insulina per 5 s. Asciugare il nervo e applicare la colla sull'area intorno ai ganci e al nervo (Figura 7c, d). Mantieni il nervo sollevato tirando leggermente l'elettrodo per circa 1 minuto per consentire alla colla di asciugarsi.
- Rimuovere i divaricatori, ad eccezione dei divaricatori sul lato destro, per evitare qualsiasi trazione o torsione dell'elettrodo. Bagnare gli organi esposti con soluzione fisiologica e stendere una garza imbevuta di soluzione salina sull'incisione.
6. Incannulamento del corpo cavernoso per la misurazione ICP
- Ripristina la visualizzazione della tunica albuginea utilizzando i divaricatori. Assicurati di non attaccare i divaricatori al muscolo ischiocavernoso in quanto distorcerà i crus.
- Collegare l'ago e sciacquare il tubo con soluzione fisiologica eparinizzata prima di introdurlo nella tunica albuginea. Mantenere la tunica albuginea tesa, utilizzando la micro pinza curva Dumont #7 in una mano (non dominante), tenendo la tunica albuginea e il resto del muscolo sovrastante distalmente al punto di inserimento. Tenere l'ago con una micro pinza diritta nell'altra mano dominante e introdurlo parallelamente al decorso del corpo cavernoso (Figura 8).
- Spingere l'ago di 5-8 mm nel corpo cavernoso. Lavare il tubo e premere sul crus per testare la linea (Figura 9). Assicurarsi che non vi siano perdite. Fissare il tubo al tavolo con del nastro adesivo per evitare tiri accidentali sulla linea. Rimuovere i divaricatori.
7. Stimolazione del CN
- Durante l'esecuzione del programma di registrazione (ad es. Spike 2), registrare continuamente la pressione arteriosa intracavernosa e media.
- Impostare i seguenti parametri su uno stimolatore (ad es. SD9 Grass Instruments, vedere la tabella dei materiali) per la stimolazione CN: corrente a 1,5 mA, frequenza a 16 Hz, tensione a 3 V e larghezza dell'impulso a 5 ms. Applicare 50 s di stimolazione con un minimo di 1 minuto di riposo tra le stimolazioni.
nota: Le prime stimolazioni di solito provocano una risposta ridotta (Figura 10).
