Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dall'appropriata revisione etica degli animali.
1. Preparazione di soluzioni e materiali
- soluzioni
- Preparare liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (in mM): 117 cloruro di sodio (NaCl), 3,6 cloruro di potassio (KCl), 1,2 sodio diidrogeno fosfato diidrato (NaH2PO4·2H2O), 2,5 cloruro di calcio diidrato (CaCl2·2H2O), 1,2 cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2·6H2O), 25 bicarbonato di sodio (NaHCO3), 11 D-glucosio, 0,4 acido ascorbico, e 2 piruvato di sodio. Vedere la tabella 1.
- Preparare una soluzione intracellulare a base di K+ (in mM): 130 K-gluconato, 5 KCl, 10 Na 2-fosfocreatina, 0,5 glicole etilenico-bis(β-amminoetletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA), acido 10 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES), 4 magnesio adenosina trifosfato (Mg-ATP) e 0,3 litio guanosina trifosfato (Li-GTP). Vedere la tabella 2.
- Preparare una soluzione intracellulare a base di cesio (Cs+) (in mM): 92 cesio metano solfonato (CsMeSO4), 43 cloruro di cesio (CsCl), 10 Na 2-fosfocreatina, 5 tetraetilammonio (TEA)-Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP e 0,3 Li-GTP. Vedi Tabella 3.
nota: Tutte le soluzioni devono essere preparate utilizzando acqua distillata. L'ACSF e il saccarosio-ACSF devono essere carbogenati (miscela al 95% di O2 e al 5% di CO2) prima dell'uso per mantenere un pH ottimale di circa 7,4 e l'osmolalità di queste due soluzioni deve essere regolata a 300-310 milliosmoli (mOsm). Poiché l'acido ascorbico potrebbe influenzare i canali del calcio, questo agente deve essere omesso se si desidera registrare le correnti di calcio. L'osmolalità e il pH delle soluzioni intracellulari devono essere misurati e regolati rispettivamente a 290-300 mOsm e 7,2-7,3. Si consiglia di filtrare le soluzioni intracellulari con filtri da 0,2 μm e conservare le soluzioni come aliquote da 1 mL a -20 °C. Cs+ e TEA vengono applicati in una soluzione intracellulare a base di Cs+ per bloccare il canale del potassio, il che favorisce l'uso dell'amplificatore per mantenere stabile il potenziale di membrana a 0 mV durante la registrazione di correnti postsinaptiche inibitorie (IPSC).
- strumenti
- Per un tipico sistema elettrofisiologico, utilizzare un microscopio verticale dotato di contrasto di interferenza differenziale a infrarossi (IR-DIC) e un obiettivo a immersione in acqua ad alta risoluzione, una telecamera CCD/CMOS, un amplificatore patch-clamp, un supporto per micropipette e un micromanipolatore che consente la regolazione fine della posizione della pipetta. Per muovere il microscopio è necessario anche uno stadio XY.
- Montare tutte le apparecchiature su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni circondato da una gabbia di Faraday. Collegare un monitor video alla videocamera per osservare i neuroni e visualizzare le micropipette.
- Micropipette
- Realizzare elettrodi di registrazione da capillari in vetro borosilicato utilizzando un estrattore per micropipette. La resistenza tipica della pipetta varia da 3 a 6 MΩ quando viene riempita con una soluzione intracellulare.
2. Registrazioni Patch-clamp a celle intere
- Per condurre le registrazioni patch-clamp dell'intera cellula dai neuroni della substantia gelatinosa (SG), utilizzare una soluzione intracellulare a base di K+ per la maggior parte dei casi di registrazione, mentre applicare una soluzione a base di Cs+ solo per la registrazione di correnti postsinaptiche inibitorie.
- Spostare delicatamente una fetta di midollo spinale nella camera di registrazione, quindi mantenerla con un filo di platino a forma di U fissato saldamente con fili di nylon per una stabilità ottimale della fetta. Perfondere costantemente la fetta con ACSF a bolle a RT attraverso un sistema a gravità e impostare la velocità di perfusione a 2-4 mL/min per ottenere un'ossigenazione sufficiente.
- Identificare la regione di SG (una banda traslucida) utilizzando una lente da microscopio a bassa risoluzione, scegliere un neurone sano utilizzando l'obiettivo ad alta risoluzione come cellula bersaglio e regolarlo al centro dello schermo del monitor video.
- Riempire una micropipetta con un volume appropriato di soluzione intracellulare a base di K+ o Cs+, se necessario, inserire la micropipetta nel portaelettrodo e assicurarsi che la soluzione intracellulare entri in contatto con il filo d'argento all'interno del supporto.
- Mettere a fuoco la micropipetta, immergerla nell'ACSF utilizzando un micromanipolatore, quindi applicare una leggera pressione positiva (~1 psi se misurata con un manometro) per forzare la micropipetta lontano da sporco e detriti.
- Spostare gradualmente la micropipetta verso il neurone bersaglio. Rilascia la pressione positiva una volta che la pipetta si avvicina al neurone e si forma una fossetta molto piccola sulla membrana neuronale per formare un gigaseal.
- Modificare il potenziale di mantenimento a -70 mV, che è vicino al potenziale fisiologico di membrana a riposo (RMP) di una cellula. Quindi, applicare un'aspirazione transitoria e delicata alla micropipetta per rompere la membrana e creare una buona configurazione di cellule intere.
nota: Dopo aver trasferito la fetta nella camera di registrazione, garantire una perfusione costante per almeno 5 minuti per eliminare i detriti sulla superficie della fetta. Vale la pena notare che la capacità di distinguere tra neuroni sani e non sani/morti è di fondamentale importanza per una buona tenuta e una registrazione stabile. Un neurone malato/morto ha un aspetto gonfio o rimpicciolito, insieme a un grande nucleo visibile, mentre un neurone sano è caratterizzato da una forma tridimensionale (3D) con una membrana luminosa e liscia, e il suo nucleo è invisibile. Per ottenere una configurazione a cella intera, è essenziale compensare la capacità rapida o lenta passo dopo passo, quando necessario. A temperatura ambiente (RT), il potenziale di giunzione del liquido è calcolato in 15,1-15,2 millivolt (mV) e 4,3-4,4 mV rispettivamente in soluzioni intracellulari a base di K+ e Cs+. Nei nostri studi, i dati registrati non sono stati corretti per il potenziale di giunzione liquida.
- Registrazioni delle proprietà intrinseche della membrana
- Registrare le proprietà di attivazione: testare il modello di attivazione di ciascun neurone nella pinza amperometrica con una serie di impulsi di corrente depolarizzante di 1 s (25-150 picoampere (pA) con incrementi di 25 pA) a RMP. Misura la soglia, l'ampiezza e la mezza larghezza di un singolo potenziale di azione offline.
Tabella 1: Ricetta per ACSF
| componente | peso molecolare | Concentrazione (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6,84 |
| Kcl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glucosio | 180 | 11 | 1,98 |
| acido ascorbico | 198,11 | 0,4 | 0,08 |
| Piruvato di sodio | 110 | numero arabo | 0,22 |
Tabella 2: Ricetta per una soluzione intracellulare basata su K+
| componente | peso molecolare | Concentrazione (mM) | mg/100 mL |
| K-gluconato | 234,2 | 130 | Codice 3044.6 |
| Kcl | 74,5 | 5 | 37.28 |
| Na2-Fosfocreatina | 453,38 | 10 | 453,38 |
| EGTA | 380,35 | 0,5 | Ore 19.02 |
| HEPES | 238,31 | 10 | 238,3 |
| Mg-ATP | 507,18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523,18 | 0,3 | 15.7 |
Tabella 3: Ricetta per una soluzione intracellulare basata su Cs+
| componente | peso molecolare | Concentrazione (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097,6 |
| CsCl | 168,36 | 43 | 723,95 |
| Na2-Fosfocreatina | 453,38 | 10 | 453,38 |
| TEA-Cl | 165,71 | 5 | 82,86 |
| EGTA | 380,35 | 0,5 | Ore 19.02 |
| HEPES | 238,31 | 10 | 238,3 |
| Mg-ATP | 507,18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523,18 | 0,3 | 15.7 |
