Registrazione dell'attività elettrica cerebrale nei topi comportamentali utilizzando sonde lineari in silicio multi-shank

Abstract

Fonte: Sauer, J., et al. Registrazione di oscillazioni spazialmente limitate nell'ippocampo dei topi comportanti. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video delinea un protocollo per l'impianto di una sonda lineare in silicio multi-shank nel cervello del topo per misurare i potenziali di campo locali. La procedura prevede il fissaggio della sonda a un'unità stereotassica, il posizionamento accurato sulla regione cerebrale bersaglio, l'inserimento nel cervello e il fissaggio con cemento dentale. Dopo l'impianto, l'assemblaggio viene protetto con un involucro. Dopo il recupero, la configurazione consente di registrare i potenziali di campo locali, fornendo informazioni sull'attività neuronale.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparativi

1. Progettare e costruire uno strumento di inserimento appropriato che trasporta transitoriamente la sonda in silicone e il connettore dell'elettrodo durante il processo di impianto. Vedere la Figura 1 per un esempio di strumento di inserimento personalizzato.
2. Rilasciare con cautela la sonda in silicone e il connettore dell'elettrodo dalla confezione utilizzando una pinza con punta in ceramica.
3. Sollevare la scheda del connettore e fissarla saldamente con un morsetto a coccodrillo fissato a un supporto.
4. Utilizzando uno stereoscopio, allineare la sonda con lo strumento di inserimento con una pinza con punta in ceramica. Applicare uno strato di cera di paraffina di ~2 mm sciolto con un cauterizzatore per incollare la sonda allo strumento di inserimento. Fare attenzione a non toccare i gambi della sonda durante questa procedura.
5. Fissare il connettore dell'elettrodo all'albero dello strumento di inserimento utilizzando un nastro adesivo standard. Si noti che, a seconda del produttore, potrebbe essere necessario saldare i fili di terra alla scheda del connettore dell'elettrodo prima dell'impianto. Rimuovere l'isolamento da due pezzi corti di filo di rame isolato con vernice utilizzando una lega di stagno applicata con un saldatore (400 °C). Saldare i fili di terra nelle apposite fessure nella scheda del connettore dell'elettrodo.
6. Rimuovere l'isolamento di due pezzi aggiuntivi di filo di rame. Avvolgere ogni filo di rame nudo tre volte attorno a una vite in acciaio inossidabile (1 mm di diametro, 2 mm di lunghezza). Applicare il flusso adatto per la saldatura dell'acciaio e saldare il filo di rame alla parte inferiore del tappo a vite. Assicurarsi che la metà inferiore della filettatura della vite rimanga priva di stagno.
7. Utilizzare un multimetro standard per verificare il contatto elettrico tra filo e vite.
8. Disinfettare i gambi della sonda al silicone e le viti di messa a terra mediante immersione in etanolo al 70% (10 s).
9. Preparare una copertura protettiva per l'impianto della sonda tagliando a metà la testa di una pipetta Pasteur in plastica.

2. Chirurgia dell'impianto

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (forbici, pinze a punta fine, pinze chirurgiche) con uno sterilizzatore a microsfere calde. Pulire tutte le superfici con etanolo al 70%.
2. Indurre l'anestesia con il 3% di isoflurano nell'ossigeno erogato a ~1 L/min.
   1. Per il mantenimento, utilizzare isoflurano all'1 - 1,5%. Si noti che la concentrazione di isoflurano necessaria per raggiungere la tolleranza chirurgica può variare da animale ad animale.
   2. La tolleranza chirurgica stabile si ottiene quando l'animale non risponde al pizzicamento delle dita dei piedi. Monitorare la frequenza respiratoria del topo e regolare la concentrazione di isoflurano se necessario.
   3. Applicare un unguento sugli occhi dell'animale per evitare che si secchi.
3. Monta il mouse in una cornice stereotassica inserendo delicatamente le barre auricolari nel condotto uditivo. Una volta che la testa del topo è stabilizzata dalle barre auricolari, posizionare un boccaglio sopra il muso per un'erogazione continua di isoflurano. Posizionare il mouse su un asciugamano o un tappetino sopra un termoforo e iniettare buprenorfina per via sottocutanea (0,05 - 0,1 mg/kg di peso corporeo) per garantire l'analgesia postoperatoria.
4. Radere la testa con un rasoio standard e disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Usando le forbici chirurgiche, praticare un'incisione nella pelle lungo la linea mediana del cranio e aprire la pelle usando i morsetti chirurgici.
5. Allineare la testa dell'animale con l'aiuto di uno strumento di allineamento stereotassico per livellare bregma e lambda. Ci dovrebbe essere meno di 50 μm di offset di altezza tra bregma e lambda. Inoltre, livellare la testa lungo l'asse mediolaterale misurando la profondità del bregma sulla superficie del cranio a distanze definite a sinistra e a destra (ad esempio, 1 mm a sinistra e a destra del bregma). Regolare l'inclinazione della testa se necessario.
6. Pulire la testina con perossido di idrogeno al 3% e asciugare con salviette di cotone sterili.
7. Determinare la posizione della craniotomia rispetto alla bregma utilizzando un atlante stereotassico appropriato.
8. Utilizzando una testa di trapano da 0,9 mm, praticare due fori per le viti nell'osso sopra il cervelletto per posizionare le viti di messa a terra e di riferimento. Inoltre, sono desiderabili da 1 a 3 fori per le viti di ancoraggio per stabilizzare l'impianto. La posizione delle viti di ancoraggio dipenderà dalla posizione della craniotomia. Per l'impianto nell'ippocampo, posizionare le viti di ancoraggio sulla corteccia frontale parietale controlaterale e omolaterale. Inserire le viti nell'osso utilizzando un cacciavite adatto. Fare attenzione a non penetrare nel cervello.
9. Eseguire la craniotomia assottigliando lentamente il cranio con la fresa in un'area rettangolare attorno al lato dell'impianto. Inumidire frequentemente l'osso con tampone fosfato sterilizzato (PB). Il cranio assottigliato rimanente può essere delicatamente forato e rimosso con l'aiuto di un ago per iniezione sottile (27G) e un paio di pinzette.
10. Forare con cautela la dura madre con un ago per iniezione sottile (27G). Formare un piccolo uncino piegando la punta dell'ago con un paio di pinzette e tirare la dura madre per la rimozione. Applicare PB per evitare che la superficie cerebrale si secchi.
11. Montare lo strumento di inserimento dell'elettrodo su un supporto stereotassico, azzerare la sonda su bregma e spostare la sonda sulle coordinate stereotassiche sopra la craniotomia. Penetra lentamente nella superficie del cervello. Assicurarsi che gli alberi della sonda non si pieghino. Evitare l'impianto attraverso i vasi sanguigni.
12. Abbassare lentamente la sonda fino a ~200 μm sopra la profondità desiderata. Coprire la craniotomia e i gambi della sonda in silicone con vaselina sterilizzata per proteggerla. Applicare del cemento dentale per fissare la base della sonda alla vite di ancoraggio nel cranio.
13. Subito dopo l'applicazione del cemento, spostare lentamente la sonda alla profondità desiderata. L'avanzamento degli ultimi ~200 μm dopo l'applicazione del cemento riduce il movimento laterale della sonda e garantisce un danno tissutale minimo nell'area target. Si noti che il tempo di indurimento del cemento utilizzato può influenzare questa fase del protocollo. Con il cemento a polimerizzazione rapida, omettere questo passaggio e impiantare direttamente la sonda alla profondità target per evitare danni alla sonda in silicone.
14. Dopo che il cemento si è indurito, rilasciare la sonda dallo strumento di inserimento sciogliendo la cera con un cauterizzatore.
15. Rilasciare la scheda del connettore dal dispositivo di inserimento e posizionarla in un punto adatto del cranio utilizzando un morsetto a coccodrillo fissato alla maniglia di inserimento. In caso di impianto di sonda nell'ippocampo, posizionare la scheda del connettore sull'osso parietale controlaterale. Fissare la scheda del connettore al cranio utilizzando del cemento dentale.
16. Saldare i fili di terra e di riferimento della scheda del connettore ai fili collegati alle due viti sopra il cervelletto.
17. Tagliare il coperchio di protezione all'altezza corretta e posizionarlo sopra la sonda in silicone. Fissare il coperchio alla scheda del connettore e al cranio utilizzando cemento dentale, evitando la pelle intorno al cranio esposto. Di solito non è necessario suturare la pelle intorno al sito di impianto.

3. Recupero dopo l'intervento chirurgico

1. Applicare un trattamento analgesico appropriato per almeno 2 giorni (ad es. iniezioni sottocutanee di buprenorfina ogni 6 ore durante il giorno e nell'acqua potabile durante la notte in combinazione con carprofene (4 - 5 mg/kg di peso corporeo) per via sottocutanea ogni 24 ore). Si consiglia un alloggiamento singolo per evitare danni all'impianto.
2. Attendere almeno una settimana per il recupero. Consulta le linee guida locali sul benessere degli animali.

4. Acquisizione dati

1. Registra LFP da mouse in movimento libero utilizzando un sistema di acquisizione dati adatto collegato tramite un commutatore. Per acquisire LFP, utilizzare una frequenza di campionamento compresa tra 1 e 5 kHz. Sono necessarie frequenze di campionamento più elevate (20 - 30 kHz) se le scariche di una singola unità devono essere registrate insieme all'LFP.
2. Memorizza i file di registrazione grezzi dei singoli canali per l'analisi offline.

Results

Figura 1: Immagine dello strumento di inserimento. La sonda in silicone è fissata a un perno per insetti incollato alla base di un morsetto a coccodrillo. L'asta del supporto può essere inserita in un micro manipolatore stereotassico per l'impianto.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morsetto a coccodrillo con supporto	Reichelt Elektronik	CAVEZZA ZD-10D
Sonda al silicio	Cambridge Neurotech	Serie P 32
stereoscopio	Olimpo	SZ51
Filo di rame isolato con vernice	Bürklin Elektronik	89 F 232
Viti di messa a terra	Viti & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
flusso	Stannol	114018
Pinze con punta in ceramica	Strumenti per la scienza	Codice 11210-60
Cera di paraffine	Sigma-Aldrich	327204
Cauterizzatore	Strumenti per la scienza	Codice: 18010-00
saldatore	Kurtz Ersa	OIC1300
etanolo	Carl Roth	9065.1
Pipette Pasteur	Carl Roth	EA65.1
Sterilizzatore a caldo	Strumenti per la scienza	Ore 18000-45
Fotogramma stereotassico	David Kopf	Modello 1900
Portaelettrodo stereotassico	David Kopf	Modello 1900
Isoflurano	Abbvie	B506
Concentratore di ossigeno	Respironix	1020007
Buprenorfina	Indivior UK Limited
Rasoio elettrico	Tondeo	Eco-XS
termoforo	Termolux	463265/-67
Pinze chirurgiche	Strumenti per la scienza	Codice: 18050-28
Perossido di idrogeno	Sigma-Aldrich	H1009
Salviette di cotone sterili	Carl Roth	EH12.1
trapano	Proxxon	Micromot 230/E
Ago per iniezione 21G	B. Braun	4657527
Soluzione salina tamponata con fosfato/soluzione salina tamponata con fosfato
Atlante stereotassico	Elsevier	9.78E+12
Forbici chirurgiche	Strumenti per la scienza	Codice 14094-11
Pinze chirurgiche	Strumenti per la scienza	Codice 11272-40
Aghi per iniezione 27G	B. Braun	4657705
vaselina
Cemento dentale	Sole Medico	SuperBond T&M
Carprofene	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
Amplificatore di registrazione	Tecnologie Intan	Codice: C3323
Scheda di acquisizione USB	Tecnologie Intan	Visualizzazione del materiale C3004
Cavi di registrazione	Tecnologie Intan	Codice: C3216
Commutatore elettrico	Lenti doriche	HRJ-OE_FC_12_HARW