Risposte postsinaptiche evocate dalla luce nei neuroni di fette di retina di topo

Abstract

Fonte: Hellmer, C. B., et al. Registrazione delle risposte postsinaptiche evocate dalla luce nei neuroni in preparazioni di fette di retina di topo adattate al buio utilizzando tecniche di patch clamp. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video dimostra la registrazione delle risposte post-sinaptiche evocate dalla luce in una preparazione di fetta di tessuto retinico di topo adattato al buio. La fetta di retina viene posta in una camera di registrazione e viene utilizzata una pipetta di registrazione per stabilire la continuità elettrica con una cellula gangliare retinica. Gli impulsi luminosi vengono applicati per generare potenziali post-sinaptici eccitatori nelle cellule ganglionari, che vengono registrati dalla pipetta.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Preparazione della Soluzione Sperimentale

1. Preparare la soluzione di dissezione da 1 giorno a 1 settimana prima dell'esperimento vero e proprio. Utilizzare una soluzione tampone di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfofonico (HEPES) per la dissezione retinica a causa della sua forte capacità tampone a temperature più basse16. Miscelare tutte le sostanze chimiche come segue (in mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl₂, 1,0 MgCl₂, 10 HEPES, 28 glucosio. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Conservare la soluzione in frigorifero fino a 1 settimana.
2. La soluzione di registrazione è il mezzo di Ames, che è un liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) progettato per le preparazioni retiniche. Entro il giorno dell'esperimento, pesare la polvere di Ames (4,4 g per 500 ml di soluzione) in un tubo. Inoltre, pesare NaHCO₃ (0,95 g per 500 ml di soluzione) e mescolare con la polvere di Ames.
3. Preparare la soluzione della pipetta intracellulare per le registrazioni con patch clamp entro il giorno dell'esperimento. Miscelare tutte le sostanze chimiche come segue (in mM): 111 K-gluconato, 1,0 CaCl₂, 10 HEPES, 1,1 acido etilenglicole tetraacetico (EGTA), 10 NaCl, 1,0 MgCl₂, 5 ATP-Mg e 1,0 GTP-Na. Regolare il pH a 7,2 con KOH. Filtrare la soluzione della pipetta con un filtro per siringa convenzionale. Prepara aliquote da ~500 μl e conservale in un congelatore o in un congelatore.

2. Preparazione per il Giorno dell'Esperimento

1. La notte prima dell'esperimento, posizionare un topo in una gabbia (C57BL/6J o sfondo simile, 4-8 settimane, maschio) in uno spazio buio per l'adattamento al buio notturno (O/N).
2. Preparazione per la dissezione:
   1. Riempire la soluzione di dissezione (100 - 200 ml) in un becher di vetro, metterla sul ghiaccio e far bollire l'ossigeno per almeno 10 minuti.
   2. Avviare l'ossigenazione della scatola scura per la conservazione della preparazione retinica.
   3. Preparare i vetrini coprioggetti di plastica con barre di grasso per le preparazioni di fette di retina e posizionare ciascuno di essi in un piatto di plastica da 35 mm.
   4. Attacca una nuova lama di rasoio a un tritatutto (affetta fazzoletti).
   5. Tagliare una membrana filtrante in due metà. Questo è per l'affettatura della retina.
   6. Allineare gli strumenti di dissezione e trasferire le pipette vicino al microscopio da dissezione. L'area di lavoro deve essere ben organizzata in modo che ogni utensile sia facilmente accessibile al buio.
3. Preparazione per le registrazioni con patch clamp:
   1. Sciogliere la polvere di Ames e NaHCO₃ in acqua distillata (Ames 4,4 g e NaHCO₃ 0,95 g/500 ml ddH₂O). Far bollire il mezzo di Ames con una miscela di ossigeno (95% O₂ e 5% CO₂) per almeno 30 minuti mentre si riscalda a un livello di temperatura di registrazione (~35 °C). Regolare il pH a 7,4 con NaHCO₃ mentre si continua a gorgogliare.
   2. Scongelare la soluzione della pipetta interna durante la dissezione. Dopo che è stato scongelato, aggiungere lo 0,01% di sulforhodamina B per la colorazione intracellulare.

3. Registrazioni del Patch Clamp dalla preparazione della fetta di retina

1. Preparazione della registrazione:
   1. Adescare i tubi di perfusione con il terreno di Ames. Lasciare passare tutte le bolle durante il riempimento del tubo.
   2. Realizzare pipette di registrazione con pinza patch con un estrattore. Per riempire una pipetta con la soluzione per pipetta, immergerla nella parte posteriore della pipetta per 1 minuto fino a quando la punta della pipetta non viene riempita. Quindi, riempire ~1/3 della pipetta utilizzando un riempitore per micropipette. Conservare ogni pipetta in una scatola umida.
   3. Accendere l'apparecchiatura per le registrazioni con patch clamp, inclusi il computer, l'amplificatore, la fotocamera CCD (Charge-Coupled Device) e il microscopio.
2. Spegni la luce della stanza. Posizionare una preparazione di fette di retina sulla camera del tavolino del microscopio utilizzando un visore a infrarossi. Dopo che è stato immobilizzato, iniziare la perfusione continua. Impostare la temperatura di perfusione da 33 a 37 °C.
3. Visualizzate la superficie della sezione con la telecamera CCD. Concentrati sulla posizione di destinazione in cui risiedono i tipi di celle di destinazione. Selezionare una cella dall'aspetto sano per la registrazione del patch clamp (ad esempio, dovrebbe avere una superficie liscia e una buona forma della cella).
4. Posizionare una pipetta di registrazione in un portapipette. Far avanzare la pipetta fino alla preparazione della fetta. Quando è vicino alla preparazione della fetta (~2 mm sopra), trovare la punta della pipetta con il microscopio. Una volta che la punta della pipetta è visibile al microscopio, spostarla verso il basso verso la cellula target.
5. Impostare l'amplificatore. Regolare la pipetta a 0 mV/0 pA (azzeramento) e avviare un impulso elettrico continuo di ~5 mV a ~10 Hz. Controllare la resistenza della pipetta; la resistenza ideale è compresa tra 5 e 10 MΩ per la maggior parte dei neuroni retinici.
6. Inizia a soffiare dalla punta. Utilizzare un boccaglio o una siringa per applicare una pressione positiva quando la pipetta si immerge nella soluzione del bagno. Soffiare continuamente la soluzione interna fino a quando la punta non si trova sulla superficie della cellula bersaglio.
   1. Quando la pressione positiva crea una piccola fossetta sulla superficie della cella, far avanzare leggermente la punta e smettere di soffiare. Controllare la resistenza della pipetta, che dovrebbe aumentare. Se è in continuo aumento, lasciarlo e monitorare la resistenza fino a raggiungere >1 GΩ (gigaseal). Se la resistenza non aumenta spontaneamente, applicare delicatamente una pressione negativa fino a quando non diventa un gigaseal.
7. Dopo aver raggiunto il gigaseal, modificare il potenziale di tenuta a -70 mV. Quindi, applicare in modo intermittente una pressione negativa per rompere la membrana all'interno del puntale della pipetta. Quando viene effettuata la configurazione a cella intera, la resistenza della pipetta può essere compresa tra 500 MΩ e 1 GΩ e si vede la corrente capacitiva. A volte si possono osservare correnti postsinaptiche spontanee.
8. Registrare la relazione corrente-tensione (I-V) da -80 a +40 mV. A seconda del tipo di cella, vengono attivati diversi tipi di canali voltaggio-dipendenti.
9. Registra le correnti o le tensioni sinaptiche evocate dalla luce.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Topi (28-60 giorni, maschi)	Laboratorio Jackson	Ceppo C57BL/6J
Polvere media di Ames	sigma	Codice: A1420	Eccellente
visualizzatore a infrarossi	Ottica del gufo notturno	NOBG1	Mostra una vista luminosa. La messa a fuoco di piccoli oggetti è un problema.
cannocchiali tascabili a infrarossi	B.E. Meyers	Cannocchiale tascabile OWL Gen 3 NV	vista eccellente
Estrattore	Sutter	P-1000	Eccellente. Realizzare pipette di dimensioni coerenti.
scatola scura	pellicano	scatola scura	Eccellente
sistema di bloccaggio patch	Scientifica	Ambito di applicazione 2000	Ottima configurazione. La maggior parte dei componenti chiave sono inclusi in un unico pacchetto. I micromanipolatori sono eccellenti.
amplificatore	Dispositivi molecolari	morsetto multiplo 700B	Controllo eccellente e facile.
Acquisizione di software	Dispositivi molecolari	Software pClamp	Controllo eccellente e facile.
sorgente luminosa (LED)	LED freddo	pE-2 Sistema a 4 canali	Eccellente
Telecamera CCD	Imaging Q	Retiga 2000	Eccellente
gabbia di Faraday	fatto a mano