Impianto subdurale di un array di elettrocorticografia morbida per la registrazione dell'elettrofisiologia corticale nei minipig

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Impianto chirurgico di array di elettrocorticografia morbida (ECoG)

1. anestesia
   1. Premedicazione: Isolare le femmine di maialino di Göttingen (n = 7) a 2-6 mesi di età (5-8 kg) e digiunare durante la notte. Iniettare una miscela di midazolam a 0,75 mg/kg, atropina a 0,25 μg/kg e haldol a 0,1 mg/kg per via intradermica e attendere che l'animale sia sedato. Pesare l'animale prima di procedere.
   2. Installazione di elettrocatetere per via endovenosa (IV):
      1. Posizionare l'animale sul tavolo operatorio su un termoforo. Indurre l'anestesia posizionando una maschera facciale sull'animale, utilizzando sevoflurano al 3%-3,5%.
      2. Posizionare gli elettrocardiogrammi sull'addome, un sensore di saturazione del sangue sulla coda e un sensore di temperatura nella narice.
      3. Posizionare un elettrocatetere endovenoso su una vena dell'orecchio e confermare l'accesso al sangue utilizzando una siringa riempita di soluzione fisiologica. Assicurati che gli occhi siano mantenuti idratati usando un unguento.
   3. Intubazione: iniettare un bolo di atracurio a 0,5 mg/kg, ketamina a 1 mg/kg e fentanil a 1-2 μg/kg. Posizionare l'animale sulla schiena per l'intubazione. Inserire un tubo da 4,5 mm.
   4. Farmaci: Dopo l'intubazione, interrompere l'anestesia con sevoflurano e installare un'infusione di propofol a 10 mg/kg/h, fentanil a 2 μg/kg/h, atracurio a 0,2-0,5 mg/kg/h e soluzione salina a 4-7 mg/kg/h. Iniziare un'infusione di mannitolo a 1 g/kg/h per ridurre il gonfiore cerebrale durante l'intervento chirurgico.
      NOTA: Un regime di analgesia multimodale può essere utilizzato se raccomandato dal comitato etico animale locale.
2. Campo asettico e preparazione della pelle: radere l'intera superficie della testa oltre il campo chirurgico. Usando un tampone sterile, strofinare accuratamente la testina con betadine. Successivamente, posizionare teli sterili sul tavolo della strumentazione e sull'animale per rivelare solo la finestra chirurgica. Infine, strofinare nuovamente la testa con un tampone sterile usando betadine.
3. Craniotomia e durotomia
   1. Taglio della pelle: incidere la pelle con un bisturi lungo la linea mediana. Separare il muscolo e il periostio (25 mm lateralmente dalla bregma su entrambi i lati e 40 mm anteriormente e posteriormente alla bregma) dall'osso utilizzando un raspatore e posizionare i divaricatori per ottenere un accesso ottimale per la successiva perforazione.
   2. Misure e marcatura: Identificare bregma e lambda e contrassegnarli con una penna chirurgica sterile (Figura 1A, B). Utilizzando un righello sterile, definire il contorno del lembo osseo centrato attorno al bersaglio dell'impianto su entrambi gli emisferi. In questo caso specifico è stata scelta la corteccia uditiva, con coordinate da -5 mm a -15 mm da bregma e da -4 mm a -20 mm lateralmente. Quindi, regolare la craniotomia in base alle dimensioni dell'impianto e ai punti di riferimento anatomici, limitando le dimensioni dell'apertura.
   3. craniotomia:
      1. Utilizzando un trapano osseo con una punta da taglio rotonda, perforare il contorno della craniotomia, tenendo conto dello spessore del cranio. Irrigare il punto di perforazione con soluzione salina per evitare il surriscaldamento dell'osso.
      2. Forare con cura il contorno in modo omogeneo fino a raggiungere la dura madre. Al primo sfondamento, finisci di forare il contorno fino a quando non si è assottigliato abbastanza da quasi sfondare. Quindi, utilizzare una spatola piatta (sulla linea mediana o sul lato laterale) per staccare il lembo osseo in un unico pezzo, usando il bordo della craniotomia come leva. Se si incontra troppa resistenza, continuare ad assottigliare l'osso.
      3. Metti il pezzo di osso in soluzione fisiologica sterile.
      4. Una volta rimosso il lembo osseo, tagliare con cura il bordo della craniotomia, usando un Kerison per evitare che il bordo osseo affilato tagli la dura madre.
      5. Se si riscontra un sanguinamento eccessivo sulla dura madre o sull'osso, utilizzare rispettivamente Gelfoam o cera per ossa. Posizionare un impacco umido (tampone standard in soluzione salina sterile) nella craniotomia e ripetere questo passaggio sull'altro emisfero (Figura 1B).
   4. Durotomia:
      1. Utilizzando l'ago di un kit di sutura 6-0, perforare e sollevare con cura la dura madre all'estremità anteriore o posteriore della craniotomia a metà strada tra il lato mediale e laterale e creare l'inizio di un'incisione con il coltello da taglio.
      2. Quindi, utilizzando una piccola spatola piatta inserita nello spazio subdurale che funge da base di taglio per proteggere la corteccia, creare una fessura anteroposteriore nella dura madre avanzando contemporaneamente con entrambi gli strumenti. Assicurarsi che la fessura sia leggermente più grande della larghezza dell'impianto (Figura 1C). Se in questo passaggio si verificano sanguinamenti o danni, coprirlo con schiuma di gel e attendere che si fermi.
         NOTA: La traiettoria della fessura deve essere adattata se nella dura madre sono presenti vasi sanguigni di grandi dimensioni per evitare sanguinamenti.
4. impianto
   1. Inserimento del dispositivo:
      1. Irrigare l'impianto (Figura 2A) con soluzione fisiologica su entrambi i lati in modo che scivoli più facilmente nello spazio subdurale. Posizionare l'impianto sopra la fessura della dura madre e, con una piccola pinza, inserire subduralmente il dispositivo facendolo scorrere in sequenza su ciascun bordo.
      2. Tenere con cura l'estremità del piedistallo del dispositivo e avanzare con l'impianto per non creare tensioni che ostacolino l'inserimento. Quando il bordo del connettore si trova sulla parte superiore della fessura, interrompere l'inserimento.
   2. Fissare l'impianto: per fissare l'impianto in posizione, posizionare un ponte in titanio sul cavo dopo il bordo della craniotomia o nelle alette di ancoraggio e fissarlo con una o due viti in titanio utilizzando l'apposito cacciavite (Figura 1D).
   3. Posizionamento a terra: rimuovere con cautela 1 cm dell'isolamento dei fili di terra e inserirlo per via epidurale all'estremità posteriore della craniotomia (o in qualsiasi posizione epidurale lontana dalla corteccia di interesse o dai grandi vasi sanguigni) (filo nella Figura 1E)
   4. Ripetere i passaggi sull'emisfero controlaterale.
   5. Chiusura della dura madre: suturare accuratamente la dura madre attorno al cavo dell'impianto utilizzando una sutura riassorbibile 3-0 e un piccolo portaago. Avvicinare il più possibile i due bordi della dura madre senza strappare la membrana sottile con il filo di sutura (Figura 1D, E).
   6. Posizionamento del lembo osseo: fissare un ponte in titanio sulla parte anteriore e posteriore di ciascun lembo osseo utilizzando una vite in titanio. Fare attenzione a pianificare il posizionamento dei ponti in Ti rispetto al posizionamento delle gambe della pedana nei passaggi successivi. Avvitare l'estremità dei ponti in titanio al cranio (Figura 1F, G).
5. Posizionamento del piedistallo e della pedana
   1. Posizionamento: In questa configurazione, la pedana ha sei gambe con due fori per le viti ciascuna (Figura 2B). Pianificare il posizionamento della pedana sul cranio per ottimizzare la posizione delle viti (evitare di posizionarle sul bordo della craniotomia o nel muscolo temporale). Salta i fori nelle gambe se non possono essere avvitati.
   2. Fissaggio della pedana: Avvitare le viti in titanio della pedana fino a quando non è saldamente in posizione (vedere la Figura 1H).
   3. Posizionamento del piedistallo: rimuovere i ponti in titanio sui cavi di collegamento e capovolgere il piedistallo per atterrare sulla pedana. Avvitare il piedistallo sulla pedana. Verificare che il piedistallo sia saldamente in posizione (Figura 1I).
6. Sutura e chiusura
   1. Pulizia della ferita: Pulire lo spazio sottocutaneo da eventuali ossa o altri detriti sciacquando con soluzione fisiologica. Tagliate un po' di pelle attorno ai bordi del piedistallo per creare un bordo rotondo che segua il cilindro.
   2. Suture sottocutanee: rimuovere gli spalmatori e piegare insieme i lembi di pelle. Creare suture sottocutanee con un filo di sutura 4-0 non riassorbibile, a 3 mm di distanza, utilizzando semplici suture interrotte o semplici suture continue. Inizia allontanandoti dal piedistallo, spostandoti verso di esso su entrambi i lati dell'incisione.
   3. Suture dermiche: sutura la pelle utilizzando un filo di sutura 6-0 non riassorbibile, con suture a 5 mm di distanza. Inizia allontanandoti dal piedistallo, spostandoti verso di esso su entrambi i lati dell'incisione. Fare attenzione a ottenere una buona apposizione dei tessuti tra i due lembi cutanei e vicino al bordo del piedistallo per evitare il vuoto (Figura 1J).
   4. Medicazione della ferita: Pulire nuovamente l'area della ferita con un tampone sterile e betadine. Applicare una benda sterile autoadesiva sulla ferita.
7. Risveglio: Dopo che tutte le misurazioni sono state eseguite, togliere all'animale tutti gli anestetici ma tenerlo sotto ventilazione. Per l'analgesia, applicare un cerotto alla buprenorfina (25 mg/h) per 24 ore. Posiziona l'animale su un termoforo coperto da teli per accelerare il tempo di sveglia. Quando la respirazione spontanea viene recuperata, estubare l'animale e metterlo sotto una maschera facciale di ossigeno fino a quando non si recupera conoscenza (operazione che può richiedere da 1 a 4 ore).
8. Cura degli animali postoperatoria: per 5 giorni, tenere l'animale sotto stretta sorveglianza. Somministrare una dose di cefalexina a 75 mg due volte al giorno con il cibo, separati dagli altri animali. Effettuare quotidianamente la disinfezione della ferita applicando abbondanti quantità di betadina con tamponi sterili imbevuti (meglio farlo durante l'alimentazione).
   nota: Assistenza a lungo termine e stabulazione: l'animale operato viene tenuto isolato per 24 ore. Viene rimesso nel suo gruppo sociale originale se l'animale sta abbastanza bene da interagire socialmente con i suoi simili. È necessario condurre un'osservazione quotidiana del piedistallo e dell'apertura della pelle per seguire l'integrazione del dispositivo sulla testa. Quando appropriato, pulire la posizione intorno al piedistallo con abbondanti quantità di betadina.

2. Registrazione elettrofisiologica

1. Attività spontanea: collegare il sistema di registrazione wireless attraverso il piedistallo e registrare l'attività di base per 2-3 minuti. Queste registrazioni serviranno come controllo per analizzare i potenziali evocati uditivi.
2. Potenziali evocati uditivi: oltre al sistema wireless, inserire gli altoparlanti in un campo chiuso nelle orecchie degli animali. Riproduci la stimolazione acustica a raf di toni a diverse frequenze (che vanno da 200 a 20.000 Hz) a circa 70 dB di livello di pressione sonora (SPL) su 120 ripetizioni. Quindi, fare la media delle registrazioni e allinearle durante il periodo di stimolo per l'analisi.
3. Potenziali evocati sensoriali: posizionare gli aghi nel muso in tre diverse posizioni. Evoca i potenziali sensoriali stimolando il muso per ~30 s con il generatore di impulsi a diverse ampiezze per ottenere le curve di reclutamento.

3. Registrazione in movimento libero

1. Seguire la stessa procedura descritta nella sezione 2 per registrare i segnali di veglia dal cervello. Collega l'headstage wireless tenendo l'animale tra le braccia dello sperimentatore o nutrendolo con bocconcini per distrarlo. Fornire la stimolazione acustica utilizzando altoparlanti esterni posizionati vicino all'animale.

Figura 1: Impianto minimamente invasivo di ECoG soft nel cervello.(A) Accesso chirurgico al cranio, con indicazione di bregma. (B) Craniotomia bilaterale con dura madre visibile. (C) Durotomia a fessura sul primo emisfero. (D) Impianto subdurale di ECoG morbida e chiusura della dura madre. (E) Durotomia a fessura sul secondo emisfero. Fissazione del lembo osseo sul primo emisfero mediante ponti in titanio. (F) Impianto di ECoG morbida sul secondo emisfero e chiusura della dura madre. (G) Fissazione del lembo osseo sul secondo emisfero. (H) Posizionamento della pedana sul cranio. (I) Fissaggio del piedistallo sulla pedana. (J) Chiusura cutanea attorno alla base del piedistallo.

Figura 2: Piedistallo compatibile con la risonanza magnetica. (A) Sistema di connessione transdermica compatibile con la risonanza magnetica cronica (piedistallo) per accedere all'array di elettrodi morbidi. (B) Piedistallo con elettrodi montati sulla pedana per l'ancoraggio del cranio. Riquadro: Dettagli della pedana.