Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Perfusione transcardica
- Sospendi una siringa da 60 ml di capacità come serbatoio per la soluzione di taglio del saccarosio a circa 18 pollici sopra il piano di lavoro (ad esempio, utilizzando un morsetto girevole a tre punte su un perno verticale). Collegare il tubo al fondo del serbatoio, far passare il tubo attraverso un morsetto a rullo e collegare l'altra estremità del tubo a un ago pulito da 20 G.
- Riempire il serbatoio da 60 ml con circa 30 ml di soluzione di saccarosio refrigerata e dirigere una linea di carbogeno nel serbatoio di saccarosio per far gorgogliare continuamente il perfusato.
nota: Assicurarsi che il saccarosio scorra attraverso il tubo e l'ago senza bolle intrappolate. La portata dovrebbe essere abbastanza veloce da avere un flusso costante e continuo di saccarosio gocciolante dall'ago.
- Usando un frullatore, schiaccia e frulla il saccarosio congelato fino a ottenere un impasto ghiacciato e usa la spatola/cucchiaio grande per distribuire l'impasto.
- Metti una piccola quantità di impasto di saccarosio attorno ai bordi del coperchio della capsula di Petri in vetro. Aggiungere una piccola quantità di impasto di saccarosio sul fondo della capsula di Petri.
- Aggiungere circa 20-30 ml di liquame di saccarosio al serbatoio del liquido di perfusione, mescolandolo bene con i 30 ml di saccarosio liquido refrigerato fino a quando il serbatoio contiene una miscela di saccarosio molto freddo, prevalentemente liquido, con un po' di soluzione congelata residua.
- Posiziona il mouse in una camera collegata a un vaporizzatore di isoflurano. Con l'ossigeno che scorre a circa 2 L/min, ruotare la manopola del vaporizzatore per erogare isoflurano al 5% di concentrazione e avviare un timer.
nota: Mantieni questo timer acceso durante il corso dell'affettatura per valutare la velocità con cui si ottengono le fette. La procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile, in modo tale che l'affettamento sia completo e che il tessuto si stia riprendendo nella camera di interfaccia entro 15-20 minuti dall'ingresso dell'animale nella camera dell'isoflurano. Osservare il mouse per assicurarsi che venga raggiunto uno stato di anestesia profonda. Dopo un minimo di 5 minuti, il topo dovrebbe essere profondamente anestetizzato e non rispondere ai pizzicamenti delle dita dei piedi.
- Immediatamente prima di rimuovere il topo dalla camera dell'isoflurano, riempire il coperchio della piastra di Petri con una soluzione di saccarosio refrigerata fino a una profondità di circa 3-5 mm e riempire il fondo della piastra di Petri con una soluzione di saccarosio refrigerata fino a una profondità di circa 1,0 cm.
- Trasferisci rapidamente il mouse sul pad assorbente sinistro e usa i 3 pezzi di nastro adesivo per fissare gli arti anteriori e la coda. Eseguire un pizzicamento del dito del dito posteriore per assicurarsi che il topo non risponda prima di eseguire qualsiasi incisione. Usando la pinza per tessuti grandi e le forbici chirurgiche, tende la pelle e pratica un'incisione longitudinale dalla parte inferiore dello sterno alla parte superiore del torace. Usando la pinza, tirare su lo sterno e usare le forbici per tagliare il diaframma.
nota: Il posizionamento iniziale del topo e le prime incisioni per recidere il diaframma devono essere eseguite il più rapidamente possibile per garantire che il topo non riprenda conoscenza. Per garantire un'adeguata profondità di anestesia durante tutta la procedura, un cono nasale può essere posizionato sul topo per erogare isoflurano durante la perfusione.
- Usa le forbici per tagliare la gabbia toracica su ciascun lato, tagliando con un unico grande movimento verso il punto in cui l'arto anteriore incontra il corpo. Con la pinza, fai oscillare la parte anteriore della gabbia toracica verso l'alto verso la testa, quindi rimuovila completamente con un taglio orizzontale usando grandi forbici. Tenere il cuore in posizione usando la pinza grande e inserire l'ago da perfusione da 20 G nel ventricolo sinistro. Una volta che l'ago è posizionato correttamente, il lato sinistro del cuore dovrebbe impallidire rapidamente poiché la soluzione di saccarosio raffreddata riempie il ventricolo.
- Usa le piccole forbici da dissettore per tagliare l'atrio destro e consentire al sangue di defluire dal sistema circolatorio. Se le incisioni vengono eseguite correttamente, il danno al cuore dovrebbe essere minimo e dovrebbe continuare a pompare durante la perfusione.
nota: Pezzi di carta velina arrotolati possono essere utilizzati per allontanare il sangue e la soluzione di saccarosio dal cuore e mantenere la visibilità dell'ago di perfusione durante la procedura.
- Assicurarsi che l'ago di perfusione rimanga in posizione e non cada dal ventricolo sinistro. Con una velocità di flusso e un posizionamento adeguati, il fegato inizierà a impallidire fino a raggiungere un colore marrone chiaro/beige con 20-30 secondi.
- Dopo 30-45 s, usa le forbici grandi per decapitare il topo. Tenendo la testa con la mano sinistra, spingere o staccare la pelle dal cranio. In un animale ben perfuso, il cranio dovrebbe essere molto pallido e il cervello dovrebbe apparire di un colore rosa molto chiaro (che si avvicina al bianco) attraverso il cranio senza vasi sanguigni chiaramente visibili.
2. Estrai il cervello e taglia le fette
- Usando le piccole forbici Bonn, fai due tagli laterali attraverso il cranio verso la linea mediana nella parte anteriore del cranio, vicino agli occhi. Fai due tagli aggiuntivi su entrambi i lati della base del cranio.
- Trasferire la testa sul fondo della capsula di Petri di vetro, dove deve essere immersa per lo più in una soluzione di saccarosio raffreddata. Usa le piccole forbici Bonn per tagliare la linea mediana lungo la lunghezza del cranio, tirando verso l'alto con le forbici per ridurre al minimo i danni al tessuto cerebrale sottostante. Usando le piccole pinze per tessuti, afferra saldamente ogni lato del cranio e fallo oscillare verso l'alto e lontano dal cervello, come aprire un libro.
- Usa le dita della mano sinistra per tenere aperti i lembi del cranio e inserisci la microspatola sotto il cervello vicino ai bulbi olfattivi. Estrai il cervello dal cranio nel saccarosio e usa la microspatola per recidere il tronco encefalico. Lavare il cervello per rimuovere eventuali residui di sangue, pelo o altri tessuti.
- Usa la spatola/cucchiaio grande per trasferire il cervello sul coperchio della capsula di Petri di vetro. Con l'altra metà della lametta a doppio taglio precedentemente messa da parte, fare due tagli coronali per rimuovere prima il cervelletto e poi la porzione più anteriore del cervello, compresi i bulbi olfattivi (Figura 1).
- Applicare l'adesivo cianoacrilato sulla rampa di agar. Posizionare molto brevemente il cervello su un pezzo di carta da filtro asciutta utilizzando la grande pinza per tessuti e quindi trasferirlo immediatamente sulla rampa di agar, posizionando la superficie ventrale del cervello sull'adesivo><.
nota: Per le fette dell'ippocampo intermedio, il cervello dovrebbe essere orientato con la parte anteriore rivolta verso l'alto rispetto al pendio della rampa e la parte posteriore più vicina alla lama. Per le fette dell'ippocampo ventrale, orientare il cervello con l'estremità anteriore rivolta verso il basso lungo il pendio della rampa, con l'estremità posteriore in cima alla rampa, più lontana dalla lama. In entrambi i casi, il cervello deve essere posizionato in cima alla rampa, in modo tale che la superficie coronale del cervello entri in contatto con il blocco di supporto dell'agar (Figura 1).
- Posizionare la piattaforma di affettatura con l'agar e il cervello nella camera di affettamento del microtomo e immergerla completamente con una soluzione di saccarosio raffreddata. Usa la spatola/cucchiaio grande per trasferire un po' di saccarosio nella camera, mescolando per sciogliere il saccarosio congelato e abbassare rapidamente la temperatura della miscela a ~1–2 °C.
nota: Guarda l'indicatore della temperatura durante l'affettatura. Se la soluzione di saccarosio si riscalda oltre i 3 °C, aggiungere altro impasto liquido e mescolare per abbassare la temperatura.
- Tagliare le fette a uno spessore di 450 μm con la velocità del microtomo impostata su 0,07 mm/s. Man mano che ogni fetta viene liberata, usa una piccola pinza per tessuti e un bisturi affilato per separare prima i due emisferi, quindi per tagliare via il tessuto fino a quando la fetta non è costituita principalmente dall'ippocampo e dalle regioni paraippocampali (Figura 1).
- Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire le fette singolarmente nella camera di recupero dell'interfaccia, assicurandosi che siano posizionate all'interfaccia tra l'ACSF e l'aria con solo un sottile menisco di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) che copre le fette. Chiudere ermeticamente il coperchio della camera e lasciare che le fette si riprendano a 32 °C per 30 minuti.
- Dopo il recupero iniziale a 32 °C, estrarre la camera di recupero dell'interfaccia dal bagno d'acqua e posizionarla su un agitatore impostato a bassa velocità in modo che l'ancoretta magnetica favorisca la circolazione dell'ACSF all'interno della camera. Lasciarlo raffreddare gradualmente a temperatura ambiente man mano che le fette si riprendono per altri 90 minuti. Assicurarsi che la camera di recupero sia continuamente imbottita di carbogeno e non lasciare che bolle di grandi dimensioni rimangano intrappolate sotto le fette.
3. Eseguire registrazioni di potenziale di campo locale (LFP) dell'attività spontanea
- Preparati per le registrazioni LFP accendendo tutte le apparecchiature necessarie, incluso il computer che esegue il software di acquisizione, il monitor collegato al computer, gli stimolatori, il micromanipolatore, il regolatore di temperatura, la sorgente luminosa del microscopio, la fotocamera collegata al microscopio, l'amplificatore per microelettrodi, il digitalizzatore e la pompa peristaltica. Se si utilizza un sistema di vuoto centralizzato, aprire la valvola a parete per preparare la linea del vuoto che rimuoverà l'ACSF dalla camera di registrazione.
- Riempire il serbatoio riscaldato con ACSF, quindi posizionare un'estremità del tubo nel becher da 400 ml contenente l'ACSF gorgogliante. Accendere la pompa peristaltica per dirigere l'ACSF dal becher da 400 ml al serbatoio riscaldato e dal serbatoio in avanti alla camera di registrazione. Toccare o pizzicare il tubo per rilasciare eventuali bolle intrappolate.
- Regolare la pompa peristaltica per assicurarsi che la portata ACSF attraverso la camera di registrazione sia veloce (~ 8–10 mL/min). Utilizzare una sonda di temperatura per assicurarsi che l'ACSF sia a 32 °C al centro della camera di registrazione.
nota: Se l'ACSF viene erogato alla camera di registrazione utilizzando una pompa peristaltica, una portata elevata può comportare una fluttuazione significativa della portata. È possibile ottenere portate costanti utilizzando un semplice smorzatore di pulsazioni costituito da una serie di siringhe vuote integrate nel tubo (Figura 2).
- Preparare le pipette di stimolazione e registrazione dai capillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore di filamenti riscaldato. Il protocollo dell'estrattore deve essere configurato per produrre pipette con una resistenza di 2-3 MOhm per la stimolazione o gli elettrodi di registrazione del potenziale di campo locale.
- Riempire le pipette di stimolazione con NaCl 1 M e le pipette LFP con ACSF.
- Brevemente clamp il tubo e spegnere la pompa per mettere in pausa il flusso di ACSF. Trasferisci una fetta nella camera di registrazione usando una pinza fine per afferrare un angolo della carta per lenti su cui poggia la fetta: la fetta si attaccherà alla carta per lenti. Posizionare la carta per lenti e affettare nella camera di registrazione con la fetta rivolta verso il basso, quindi "staccare" la carta per lenti lasciando la fetta immersa nella camera di registrazione. Fissare la fetta utilizzando un harp.
nota: Le arpe possono essere acquistate prefabbricate o realizzate in laboratorio utilizzando un pezzo a forma di U di acciaio inossidabile o platino e filamento di nylon fine.
- Posizionare una pipetta di stimolazione riempita con NaCl nel micromanipolatore manuale e far avanzare lentamente la punta della pipetta sulla superficie della fetta (ad esempio, nello strato di radiato) con un angolo di circa 30-45°. Una volta che la punta della pipetta entra nel tessuto, far avanzare lentamente la pipetta in avanti ed evitare movimenti ampi in direzione laterale o verticale che potrebbero danneggiare inutilmente gli assoni all'interno della fetta. Posizionare la punta della pipetta ad almeno 50-100 μm di profondità nella fetta per evitare che le cellule vicino alla superficie siano state danneggiate durante l'affettatura.
- Posizionare una pipetta LFP riempita con ACSF nel portapipette collegato al micromanipolatore motorizzato. Applicare una pressione positiva molto leggera utilizzando la pressione della bocca o una siringa da 1 ml collegata tramite una valvola di arresto e un breve tratto di tubo al supporto della pipetta.
nota: Posizionare le pipette LFP all'interno della fetta in modo da registrare i segnali di interesse: in caso di forti increspature d'onda, una pipetta LFP deve essere posizionata nello strato piramidale (SP) e una seconda pipetta nello strato radiato (SR). Questa configurazione consente registrazioni simultanee dell'onda acuta negativa nell'SR e dell'oscillazione dell'ondulazione ad alta frequenza nell'SP (Figura 3).
- Utilizzando il micromanipolatore, far avanzare lentamente la punta della pipetta LFP nella regione di interesse (ad esempio, lo strato di cellule piramidali CA1) con un angolo di circa 30-45°. Posizionare la punta della pipetta ad almeno 50-100 μm di profondità nella fetta per evitare che le cellule vicino alla superficie siano state danneggiate durante l'affettatura. Durante l'avanzamento della pipetta LFP, erogare continuamente un piccolo impulso di test di tensione utilizzando il software di acquisizione e osservare un improvviso aumento della resistenza dell'elettrodo. Ciò può indicare che la pipetta è stata ostruita o premuta contro una cellula.
- Una volta che la pipetta LFP è posizionata nella regione di interesse, rilasciare con cautela la pressione positiva aprendo la valvola sul tubo collegato al supporto della pipetta.
- Per registrare contemporaneamente l'LFP in una seconda posizione, ripetere i passaggi 6.8-6.10 con una seconda pipetta e un micromanipolatore.
- Utilizzare l'amplificatore a microelettrodi nella configurazione a pinza amperometrica per registrare l'attività spontanea nel potenziale di campo locale dopo aver utilizzato la funzione di bilanciamento del ponte nel software di acquisizione per correggere la resistenza in serie della pipetta. Le increspature spontanee delle onde acute (SWR) appariranno come deflessioni positive nel potenziale extracellulare dello strato SP (Figura 3).
- Per registrare i potenziali di campo evocati, utilizzare gli stimolatori collegati al digitalizzatore per erogare un breve impulso di tensione quadra (200 us) attraverso la pipetta di stimolazione riempita di NaCl. Regolare la manopola della tensione di stimolazione per evocare una gamma di ampiezze di risposta.
