Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Configurazione della registrazione elettrofisiologica
- Fissare la pelle dell'orecchio esterno del topo (padiglione) alla base rivestita di PDMS di una camera di registrazione con sottili spilli di insetto attorno ai bordi (~6-8 per orecchio), posizionando i nervi puliti alla base dell'orecchio vicino a due elettrodi di aspirazione: uno per la registrazione (per prendere il nervo) e l'altro un elettrodo indifferente (per fornire il segnale neutro a un amplificatore differenziale).
- Per l'elettrodo di registrazione, abbinare attentamente l'apertura e il diametro interno dell'apertura allo spessore combinato dei due nervi, in modo che si adattino il più comodamente possibile e per la massima lunghezza possibile.
- Aspirare i nervi nell'elettrodo aspirando delicatamente da una siringa da 2 ml attaccata all'altra estremità con un tubo di gomma siliconica. Assicurati che i nervi siano dritti, non piegati o raddoppiati.
- Sviluppa un adattamento ad alta resistenza/impedenza elettrica utilizzando un'aspirazione più forte per attirare il tessuto connettivo o il tessuto adiposo per formare un tappo che sigilla ermeticamente l'apertura attorno al nervo.
- Se necessario, riempire l'altro elettrodo (indifferente) con soluzione fisiologica per aspirazione (può essere riempito per azione capillare).
- Posizionare fili di registrazione identici (argento o platino) nel foro interno degli elettrodi di registrazione per entrare in contatto con la soluzione salina e il nervo (registrazione) o l'estremità ristretta e lucidata a fuoco (indifferente) dell'elettrodo. Ogni elettrodo è saldato individualmente a diversi conduttori di cavo schermato a due conduttori. Posizionare l'elettrodo del bagno (massa) (pellet Ag/AgCl) nel bagno e metterlo a terra sullo schermo del cavo a due conduttori collegato agli elettrodi di registrazione.
- Alimentare l'attività elettrica dai due elettrodi nei canali separati di un amplificatore differenziale, filtrare (passa-banda 0,2-2 kHz) e visualizzare sullo schermo di un oscilloscopio. Verificare che i livelli di rumore elettrico del canale A (registrazione) e del canale B (indifferente) siano simili. In questa fase potrebbe non essere possibile vedere i normali potenziali d'azione spontanei nel canale A prima che i due elettrodi siano bilanciati.
- Correggi eventuali differenze di rumore di fondo tra gli elettrodi aumentando l'impedenza degli elettrodi di registrazione (canale A) o indifferenti (canale B). A tale scopo, aspirare ulteriormente il tessuto connettivo areolare (adiposo) in uno degli elettrodi e/o applicare una maggiore forza di aspirazione sulla siringa da 50 ml.
- Una volta "bilanciato" in questo modo, torna alla registrazione differenziale (A-B) e cerca i potenziali d'azione spontanei (AP) nella traccia o quando accarezzi i peli ai margini del padiglione. Se non si nota alcuna attività (spiking), ricontrollare l'aderenza del nervo nell'elettrodo di registrazione e il tessuto connettivo areolare nell'elettrodo indifferente: di solito, più stretta (maggiore resistenza) è la tenuta e più uguale è l'impedenza nei due elettrodi, meglio è. Con la pratica, questo otterrà un rapporto segnale:rumore di buona qualità (>2:1).
- Registra l'elettroneurogramma tramite un'interfaccia di laboratorio e un software di elettrofisiologia in esecuzione su un computer. Un'uscita audio di spiking è molto utile e può essere ottenuta alimentando il neurogramma attraverso un amplificatore audio e un altoparlante audio associato. Regolare la soglia in modo che sia appena al di sopra del rumore di base (identificato dall'assenza di "sibilo" del rumore bianco).
- Per aumentare l'accesso del farmaco o del colorante stirrile fluorescente alle terminazioni lanceolate, staccare con cura lo strato adiposo sottocutaneo vicino al margine del padiglione auricolare, aprendo una finestra di ~5 mm x 5 mm, esponendo il derma e la base dei follicoli (Figura 1A, B).
- Appuntare una piega di ~1 mm di pelle dell'orecchio adiposa sul margine iniziale (a livello della finestra appena prodotta, se applicabile), lasciando uno spazio libero riempito di soluzione salina tra gli strati cutanei apposti. Accarezzare delicatamente i peli che sporgono lungo il bordo piegato con uno spillo o una pinza fine messa a terra, senza toccare la pelle, per individuare l'area dell'uscita AP massima sull'oscilloscopio e i caratteristici "clic" e "pop" nell'uscita audio.
2. Registrazione dei potenziali d'azione evocati dallo stimolo
- Posizionare la sonda di stimolazione meccanica - un microelettrodo borosilicato di vetro da 10 cm lucidato a fuoco collegato a un attuatore piezoelettrico in ceramica - in modo che il movimento sia parallelo alla piega della pelle. Posiziona la punta a circa 0,5-1 mm dalla piega della pelle, in modo che tocchi i peli ma non la pelle. Verificare l'efficacia della stimolazione muovendo lentamente e manualmente la punta della sonda per deviare i peli e osservare/ascoltare lo spiking.
- Utilizzare il software per guidare la stimolazione meccanica di 1-3 capelli (ad es. 3 secondi a sinusoidi a 5 Hz, ogni 10 sec. Spostamento della sonda 200-500 μm) e registrare le risposte evocate dalla stimolazione nei nervi.
- Somministrare diversi treni di stimolazione meccanica identici a intervalli di 10 secondi. Ottimizzare la posizione della sonda per la ripetibilità, quindi ridurre la frequenza di stimolazione secondo il protocollo sperimentale (ad es. velocità di ripetizione della caduta da 10 sec a 30 sec).
- Utilizzare il software per discriminare l'attività simile all'AP, ad esempio utilizzando una soglia semplice impostata su ~2 volte l'ampiezza del rumore ad alta frequenza e ~25% degli AP più grandi.
- Conta gli AP che superano la soglia come "eventi", quantificando la frequenza e le caratteristiche degli AP prodotti.
3. Registrazione dell'attivazione evocata dallo stimolo combinata con l'etichettatura di N-(3-trietilammoniopropil)-4-(4-(dibutilammino) stiril) piridinio dibromuro
- Per esaminare gli effetti dei coloranti stirilici sull'attivazione afferente evocata dallo stimolo e sulla marcatura terminale, aggiungere la concentrazione appropriata di un colorante stirrile di scelta alla soluzione balneare e continuare con la registrazione elettrica.
- Dopo il tempo di esposizione richiesto (di solito almeno 30 minuti), preparare la preparazione per la visualizzazione dei follicoli. Aprire il lembo cutaneo rimuovendo i perni di fissaggio ed esporre l'area dermica ripulita per rivelare l'etichettatura terminale.
- Lavare via il colorante esterno con soluzione salina priva di coloranti, effettuando 3 cambi completi di soluzione salina.
- Incubare nel cambio finale di soluzione salina gassata senza colorante per 10-15 minuti per consentire alla contaminazione del colorante più persistente di lisciviare dalle membrane esposte/esterne.
- Rimuovere il colorante non internalizzato rimasto sulle membrane con un agente sequestrante (beta-ciclodestrina solfobutilata, 1 mM, 5 min) in soluzione fisiologica.
- Trasferire la camera di registrazione sul tavolino di un microscopio a epifluorescenza verticale e innestare la camera con il meccanismo di movimento del tavolino/vetrino.
- Illuminare la preparazione con una luce di eccitazione appropriata per il colorante stirile. Utilizzare un obiettivo per microscopio a fluorescenza 10X o 25X per osservare la marcatura dei follicoli (Figura 1).
