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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di elettrodi e cavi per registrazioni EEG/EMG
- Preparare l'elettrodo di registrazione EEG/EMG secondo la seguente procedura.
nota: L'elettrodo è monouso e può essere utilizzato solo per 1 animale. Pianificare attentamente la configurazione del cablaggio per tutti i connettori. Posizionare dei segni sui connettori per il corretto orientamento.
- Saldare ogni pin di un connettore a 4 pin a un filo di acciaio inossidabile di 2 cm. In breve, tieni un'estremità del filo sul perno, posiziona un saldatore caldo sul giunto filo-pin e sciogli un po' di saldatura per assicurarti che la saldatura sufficiente scorra uniformemente nel giunto. Fare attenzione a non applicare troppo calore al perno; In caso contrario, la plastica attorno ai perni si scioglierà.
- Saldare l'estremità libera di ciascuno dei 2 fili attaccati all'intestazione del pin alla testa di una vite in acciaio inossidabile di 1,0 mm di diametro. In breve, tenere l'estremità libera del filo sulla filettatura sotto la testa della vite, posizionare un saldatore caldo sul giunto filo-vite e fondere un po' di saldatura per assicurarsi che la saldatura sufficiente scorra uniformemente nel giunto. I 2 fili con viti fungono da elettrodi di registrazione EEG, mentre i 2 fili senza viti fungono da elettrodi di registrazione EMG.
- Utilizzare le forbici per rimuovere 1 mm di isolamento all'estremità degli elettrodi EMG per aumentare la qualità del segnale EMG.
- Coprire completamente tutti i pin saldati con adesivo epossidico utilizzando un bastoncino di legno sottile o uno stuzzicadenti per ridurre il rumore elettrico durante le registrazioni EEG/EMG.
- Preparare un cavo per collegare l'elettrodo con l'anello rotante come descritto di seguito. Questo cavo può essere riutilizzato.
- Saldare ogni pin di un connettore FFC/FPC a 4 pin con un filo di un cavo piatto da 30 cm. In breve, tenere l'estremità spelata del filo al perno, posizionare un saldatore caldo sul giunto filo-perno e fondere un po' di saldatura per assicurarsi che la quantità di saldatura scorra uniformemente nel giunto.
Nota: Scegliere la lunghezza del cavo piatto appropriata per l'altezza della gabbia per animali da esperimento utilizzata per le registrazioni EEG/EMG.
- Saldare le prese a crimpare a una punta dei fili sull'altra estremità del cavo piatto. In breve, tenere una presa a crimpare sull'estremità libera spelata del filo, posizionare un saldatore caldo sul giunto della presa del filo e fondere un po' di saldatura per assicurarsi che la saldatura sufficiente scorra senza intoppi nel giunto.
- Inserire ciascuna presa a crimpare in un alloggiamento a crimpare a 4 posizioni.
- Coprire completamente le prese a crimpare con adesivo epossidico utilizzando un bastoncino di legno sottile o uno stuzzicadenti.
2. Impianto di elettrodi nella testa del topo (durata: circa 20 minuti)
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in uno sterilizzatore a microsfere calde prima dell'intervento. Anestetizzare un topo maschio (10-20 settimane di età, 20-30 g) con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (50 mg/kg). Dopo aver verificato che il topo sia profondamente anestetizzato pizzicando un dito del piede, radere i peli della testa e del collo con un tagliacapelli.
- Sposta il mouse sul telaio stereotassico e fissa la testa tra le 2 barre auricolari. Applicare vaselina sugli occhi per prevenire la secchezza. Detergere la pelle rasata con alcool e tagliarla lungo la linea mediana con un bisturi per esporre il cranio. Agganciare la pelle per mantenere aperta l'area chirurgica.
- Utilizzando una fresa in metallo duro (dimensione della punta: 0,8 mm di diametro), praticare 2 fori nel cranio, uno sopra l'area corticale frontale (1 mm anteriormente al bregma, 1,5 mm lateralmente alla linea mediana) e l'altro sopra l'area parietale (1 mm anteriormente alla lambda, 1,5 mm lateralmente alla linea mediana) dell'emisfero destro, secondo le coordinate stereotassiche di Paxinos e Franklin.
- Utilizzando un cacciavite da gioielliere, posizionare le viti di registrazione EEG in acciaio inossidabile nei fori e fare 2 - 2,5 giri per ciascuna vite per il posizionamento epidurale sulla corteccia><.
NOTA: Non inserire le viti troppo in profondità per evitare danni al tessuto cerebrale. Verificare che le viti siano ben fissate sul cranio. Questo è importante per avere segnali EEG stabili durante un lungo periodo di registrazioni multiple (in genere, più di 1 mese). Le viti ondulate producono artefatti EEG e possono staccarsi prima della fine del programma sperimentale.
- Fissare il gruppo elettrodo (cfr. Sezione 1.1, perni rivolti verso l'alto) con colla istantanea sul cranio e coprirlo con cemento dentale. Praticare piccoli fori bilateralmente con una pinza nei muscoli del trapezio (collo) e inserire i fili di acciaio inossidabile che fungono da elettrodi EMG nei fori. Sutura la pelle con un filo di seta (0,1 mm di diametro) per evitare l'esposizione del muscolo.
- Rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica. Somministrare ampicillina (100 mg/kg) e meloxicam (1 mg/kg) per via intraperitoneale al topo per evitare l'infezione batterica e ridurre il dolore post-chirurgico, rispettivamente. Tieni il mouse su un termoforo e monitoralo fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Alloggiare il topo individualmente durante il recupero per evitare la rimozione degli elettrodi da parte di altri animali e somministrare meloxicam (1 mg/kg) per via intraperitoneale il primo giorno dopo l'intervento.
3. Registrazione e acquisizione di dati EEG/EMG
- Dopo un periodo di recupero di 1 settimana, alloggiare ogni topo individualmente in una gabbia sperimentale collocata in una camera di registrazione insonorizzata. Mantenere una temperatura ambiente di 23 ± 1 °C e controllare automaticamente i cicli di 12 ore di luce/12 ore di buio (luci accese alle 08:00, intensità di illuminazione ~ 100 lux).
- Collegare il gruppo elettrodo EEG/EMG sulla testa del mouse a un cavo di registrazione. Assicurarsi che il cavo di registrazione sia collegato a un anello di contatto (progettato in modo che i movimenti del mouse non siano limitati dalla torsione del cavo) e a un amplificatore di segnale EEG/EMG. Filtrare i segnali EEG/EMG (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), digitalizzare a una frequenza di campionamento di 128 Hz con un convertitore analogico-digitale (A/D) e infine registrare su un computer che esegue un software di registrazione EEG/EMG.
- Abituare il mouse per 2 - 3 giorni nella camera di registrazione.
- Successivamente, avviare il software di registrazione EEG/EMG.
- Seleziona la scheda "Informazioni sul file di dati" e fai clic sulla casella accanto al nome del file. Inserisci un nome per il file e fai clic su "Salva".
- Selezionare la scheda "Condizione di registrazione" e selezionare tutti i canali EEG/EMG che verranno registrati.
- Selezionare la frequenza di campionamento (128 Hz) nella scheda "Condizione di registrazione".
- Controlla se i canali selezionati vengono visualizzati correttamente nella scheda "Informazioni sul canale".
- Seleziona la scheda "Impostazioni timer" e fai clic su "Monitor" per visualizzare EEG ed EMG.
- Verificare che i segnali EEG/EMG vengano visualizzati correttamente.
- Selezionare la scheda 'Impostazione timer' e impostare l'ora dell'orologio per l'inizio e la fine della registrazione nell'area 'Timer principale'.
- Fare clic su "Monitor" nella scheda "Impostazioni timer" per avviare la registrazione.
- Registra i segnali EEG/EMG sotto la linea di base (ad esempio, il comportamento di sonno/veglia di un topo che si comporta liberamente). Eutanasia del topo con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (200 mg/kg) dopo l'ultimo giorno sperimentale.