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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Seziona e prepara la Larvale di Drosophila SNC
NOTA: I metodi per la dissezione larvale del SNC sono chiaramente illustrati in Hafer e Schedl, ma questi metodi precedentemente pubblicati riducono la lunghezza dei neuroni discendenti che sono importanti per misurare la frequenza dei picchi. Qui, viene delineato un metodo aggiuntivo per asportare il SNC larvale che mantiene i neuroni discendenti lunghi e intatti.
- Preparazione salina.
- Preparare la soluzione fisiologica di dissezione e registrazione come segue in mM: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etanosolfonico acido (HEPES); titolare il pH a 7,25.
- Sezionare la larva di Drosophila SNC.
- Identificare ed estrarre un terzo stadio errante di Drosophila melanogaster dalla fiala di coltura e inserirlo in 200 μL di soluzione fisiologica (Figura 1A).
- Afferrare i ganci della bocca con un paio di pinze sottili e afferrare l'addome del verme con un secondo paio di pinze (Figura 1B).
nota: Non applicare troppa pressione sull'addome in quanto ciò può provocare la lacerazione del sottile strato cuticolare del verme.
- Tirare delicatamente i ganci della bocca e l'addome in direzioni diverse per separare l'estremità caudale del verme dalla regione della testa ed esporre i visceri del verme (Figura 1C).
nota: Il SNC sarà intrecciato con la trachea e il tratto digestivo. Non tagliare il SNC da alcun tessuto per evitare di tagliare i nervi periferici discendenti.
- Estrarre il SNC dal tratto digestivo e dalla trachea con una pinza (Figura 1D).
- Se necessario, interrompere la barriera ematoencefalica sezionando manualmente il SNC posteriore ai lobi cerebrali con le forbici a molla di Vannas.
nota: Questo dovrebbe essere fatto in base alle proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica utilizzata. La linea rossa nella Figura 2A è il punto di transezione suggerito e il SNC sezionato con tronchi nervosi periferici discendenti intatti mostrati nella Figura 2B. Il SNC sezionato è pronto per la sperimentazione dopo il completamento del passaggio 1.2.5.
2. Registrazione extracellulare del SNC di Drosophila.
- Preparare il SNC per la registrazione.
- Estrarre un elettrodo per pipette in vetro dai capillari in vetro borosilicato a una resistenza di 5-15 mΩ.
- Inserire il SNC sezionato nella camera della cera che contiene 200 μL di soluzione fisiologica. Bloccare un perno per insetti non rivestito con la clip a coccodrillo saldata al filo di terra e inserire il perno nella soluzione salina per completare il circuito.
- Utilizzando i micromanipolatori, orientare l'elettrodo verso l'estremità caudale del SNC sezionato. Elimina la registrazione del rumore di fondo regolando il livello di soglia nel software di acquisizione/analisi prima di entrare in contatto con i tronchi nervosi periferici.
- Aspirare tutti i nervi periferici convenienti nell'elettrodo di aspirazione applicando una leggera pressione negativa sulla siringa.
nota: La frequenza di attivazione di base è correlata al numero di neuroni attirati nell'elettrodo, dove più neuroni spesso provocano un aumento della resistenza dell'elettrodo.
- Iniziare la registrazione extracellulare dell'attività del nervo discendente del SNC.
- Avviare la registrazione sul software di acquisizione dati e monitorare la frequenza di sparo di base. Lasciare che la velocità di sparo si equilibri per 5 minuti prima di raccogliere i dati sulla velocità di sparo di base.
- Scartare la preparazione e la registrazione se il modello di attivazione del trattamento di controllo non è un modello di scoppio simile a quello mostrato nella Figura 3A.
nota: Un modello alterato di attivazione suggerisce un'attività anormale o instabile del generatore di pattern centrale, che può alterare la funzione neurale.
- Dopo 5 minuti, aggiungere 200 μL di soluzione fisiologica + veicolo per portare il volume totale della camera a 400 μL per iniziare a registrare le velocità di sparo di controllo.
- Dopo che il basale è stato stabilito (3-5 minuti), prelevare 200 μL di soluzione fisiologica e aggiungere 200 μL dell'agente sperimentale solubilizzato in soluzione fisiologica.
nota: Il dimetilsolfossido (DMSO) è il solvente raccomandato per i composti lipofili e non deve superare lo 0,1% v/v.
- Applicare le concentrazioni del farmaco in modo seriale (concentrazioni da basse ad alte) e registrare ciascuna concentrazione per un periodo di tempo selezionato (determinato dallo sperimentatore in base alle proprietà chimiche del farmaco). Etichettare questo punto temporale di applicazione del farmaco nel software di acquisizione/analisi includendo un commento che includa il farmaco e la concentrazione finale.
nota: L'attività di attivazione del SNC diminuirà di circa il 10-20% dopo 30-50 minuti dopo la dissezione e, pertanto, dovrebbero essere eseguiti appropriati controlli non trattati e i trattamenti farmacologici non dovrebbero superare questo periodo di tempo.
