Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione del Setup MEA
Nota: Inizia 15 minuti prima della registrazione.
- Trasferire il volume rimanente di 4AP-ACSF (liquido cerebrospinale artificiale 4-amminopiridina) in un matraccio di Erlenmeyer da 500 mL.
- Posizionare il pallone di Erlenmeyer su uno scaffale sopra l'amplificatore MEA (Microelectrode arrays) e utilizzare un tubo per consentire alla soluzione di alimentare continuamente una siringa da 60 ml. Regolare l'altezza del pallone di Erlenmeyer e della siringa per consentire una velocità di alimentazione per gravità di 1 mL/min.
nota: L'altezza corretta dipende dal diametro interno del tubo (ID). Per tubi di diametro interno 5/32 pollici, sono sufficienti 30 cm.
- Iniziare a far gorgogliare il 4AP-ACSF nel pallone di Erlenmeyer e nella siringa con una miscela di gas 95% O2/5% CO2 2.
- Lasciare che il 4AP-ACSF scorra attraverso il tubo di perfusione in un becher fino a quando non c'è più aria all'interno; quindi arrestare il flusso della soluzione.
- Collegare l'elemento riscaldante alla base MEA al termostato. Posizionare il chip MEA asciutto all'interno dell'amplificatore MEA e fissare la testa dell'amplificatore. Una pipetta Pasteur in plastica trasferisce 4AP-ACSF all'ingresso e al serbatoio esterno della camera di registrazione.
- Fissare la cannula riscaldante a un supporto magnetico e posizionare la punta all'interno della porta di ingresso della camera di registrazione. Fissare il supporto magnetico a una striscia magnetica sul MEA amptesta dell'amplificatore. Collegare il tubo di perfusione alla cannula. Collegare la cannula al termostato.
nota: La cannula riscaldante deve essere coperta da un tubo smussato in politetrafluoroetilene (PTFE) per raggiungere la porta di ingresso della camera di registrazione e ridurre al minimo il rumore dovuto al suo materiale metallico. Quando il serbatoio di ingresso è adeguatamente riempito con 4AP-ACSF, le gocce che cadono dal sistema di perfusione non dovrebbero essere visibili.
- Posizionare l'ago di aspirazione all'interno del serbatoio e verificare che vi sia una pressione negativa immergendolo nell'ACSF; verificare la presenza di un rumore di aspirazione costante a bassa frequenza.
nota: L'ago di aspirazione deve essere posizionato in modo che il 4AP-ACSF scorra appena sopra la superficie della fetta cerebrale. È possibile utilizzare una linea del vuoto o una pompa per vuoto a bassa rumorosità.
- Impostare il regolatore di flusso in modo che consenta una portata di 1 mL/min e iniziare a perfondere.
nota: La perfusione alimentata per gravità elimina il rumore che potrebbe essere causato dalle pompe peristaltiche; Se si preferiscono le pompe peristaltiche, sono obbligatori i modelli a bassa rumorosità.
- Una volta che 4AP-ACSF scorre attraverso la cannula, accendere il termostato. Impostare la cannula riscaldante a 37 °C e la base MEA a 32 °C per raggiungere una temperatura di 32 - 34 °C all'interno della camera di registrazione.
NOTA: ATTENZIONE! Non riscaldare mai la cannula senza soluzione al suo interno, altrimenti potrebbe danneggiarsi irreversibilmente. Impostare la temperatura della cannula su un valore superiore alla temperatura di registrazione (ad esempio, 32 - 34 °C) per tenere conto dell'offset di temperatura intrinseco tra il valore impostato e il valore effettivo sulla punta della cannula riscaldante e all'interno della camera di registrazione. La portata, la temperatura ambiente e il volume della camera di registrazione influenzano la temperatura della soluzione di registrazione. Le impostazioni riportate nel passaggio 1.9 sono ottimizzate per il protocollo e l'apparecchiatura descritti. Controllare sempre la temperatura di registrazione effettiva utilizzando una termocoppia e regolare le impostazioni secondo necessità. Non riscaldare la base MEA oltre i 34 °C per evitare il surriscaldamento della fetta di cervello.
- Posizionare l'elettrodo di riferimento esterno nel serbatoio di ingresso della camera di registrazione.
nota: Sebbene i chip MEA siano dotati di un elettrodo di riferimento interno, la camera di registrazione personalizzata copre questo aspetto. Pertanto, è necessario utilizzare un elettrodo di riferimento esterno. Un pellet saturo di KCl (cloruro di potassio) è il più pratico poiché è pronto per l'uso senza bisogno di clorazione.
2. Mappatura in tempo reale MEA
- Una volta che il livello 4AP-ACSF e la temperatura di registrazione si sono stabilizzati come desiderato, ruotare i rubinetti di perfusione e aspirazione in posizione off per arrestarli temporaneamente.
- Trasferire rapidamente una fetta di cervello sulla camera di registrazione MEA utilizzando una pipetta Pasteur in vetro rovesciato. Regolarne la posizione sull'area di registrazione MEA secondo necessità utilizzando una pipetta Pasteur arricciata lucidata a fuoco (Figura 1C) o uno spazzolino morbido e compatto. Posizionare l'ancora di fissaggio (Figura 1D) sulla fetta di cervello. Riavviare la perfusione e l'aspirazione riportando i rubinetti in posizione on.
NOTA: FONDAMENTALE! La fetta deve essere trasferita e la perfusione deve essere ripresa entro 60 s, altrimenti il tessuto potrebbe morire. L'ancora di tenuta della fetta deve essere mantenuta in 4AP-ACSF per evitare che la fetta di cervello si muova mentre si posiziona l'ancora sulla fetta di cervello a causa delle differenze di tensione superficiale. L'ancoraggio per fissare la fetta di cervello sul MEA può essere realizzato su misura utilizzando filo di acciaio inossidabile e filo di nylon (Figura 1D) o ottenuto da fonti commerciali. La Figura 1E mostra la configurazione sperimentale finale con il chip MEA collegato alla testa dell'amplificatore: una fetta di cervello appoggiata sul chip MEA all'interno della camera di registrazione è tenuta premuta dall'ancora personalizzata. L'elettrodo di riferimento (cerchio rosso) e il tubo in PTFE che copre la cannula di riscaldamento (freccia rossa) sono posizionati nel serbatoio di ingresso, mentre l'ago di aspirazione (freccia blu) è posizionato nel serbatoio di uscita.
- Scatta una foto della fetta di cervello usando una fotocamera montata su un tavolino per microscopio invertito.
- Eseguire lo script mapMEA sul software del computer per avviare la GUI per mappare gli elettrodi.
nota: Il software su misura consente all'utente di selezionare gli elettrodi che corrispondono a strutture specifiche della fetta di cervello. Questo passaggio è fondamentale per attivare il percorso corretto e sopprimere l'attività ictale utilizzando la stimolazione elettrica.
- Fare clic sul pulsante Sfoglia per caricare l'immagine della fetta di cervello. Assicurarsi che l'elettrodo di riferimento appaia nella riga superiore del semilato sinistro del MEA (Figura 2A, segno del triangolo). Fare clic sul pulsante Attiva puntatore, quindi selezionare gli elettrodi superiore e inferiore nella riga più a sinistra dell'array per contrassegnare le coordinate XY per il raddrizzamento dell'immagine e la mappatura degli elettrodi.
- Dal menu a discesa del tipo di sezione, selezionare Orizzontale. Seleziona la casella di controllo Strutture predefinite.
nota: E' possibile personalizzare le strutture selezionando il pulsante Inserisci Nuove Strutture. Le strutture predefinite per la fetta orizzontale del cervello sono illustrate nella Figura 2A.
- Utilizzando i pulsanti numerati sotto l'immagine della fetta di cervello, selezionare gli elettrodi corrispondenti alla ROI e fare clic sul pulsante corrispondente nel pannello delle strutture per assegnarli (Figura 2B); ripetere questo passaggio per ogni ROI.
- Premi il pulsante Salva: il software genera una cartella dei risultati denominata #EXP_LabelledElectrodes contenente una tabella che riporta gli elettrodi selezionati e le ROI.
3. Registrazione e modulazione elettrica dell'attività epilettiforme
- Lasciare che la fetta di cervello si stabilizzi all'interno della camera di registrazione per 5 - 10 minuti prima di registrare.
- Accendere l'unità di stimolo almeno 10 minuti prima del protocollo di stimolazione per consentire l'autocalibrazione e la stabilizzazione. Avviare il software di controllo dello stimolo e verificare che lo stimolatore e l'amplificatore MEA siano collegati correttamente, come indicato da un LED verde nel pannello principale del software di controllo dello stimolo.
- Impostare la stimolazione in una configurazione bipolare. Selezionare le coppie di elettrodi a contatto con lo strato di celle piramidali del CA1/subiculum prossimale (cfr.24,25) tra quelle mappate con lo script mapMEA (cfr. sezione 12). Utilizzare un filo per collegare uno degli elettrodi selezionati alla spina negativa dello stimolatore e l'altro elettrodo alla spina positiva dello stesso canale dello stimolatore. Utilizzare un altro filo per collegare la massa dello stimolatore alla massa dell'amplificatore.
- Avviare il software di registrazione. Per acquisire i dati, premere il pulsante PLAY nel pannello principale del software di registrazione. Registrare almeno 4 secrezioni ictali.
nota: Una frequenza di campionamento di 2 kHz consente di acquisire potenziali di campo con una risoluzione discreta, riducendo al minimo l'utilizzo dello spazio su disco rigido. Un file di registrazione di 5 minuti occupa ~80 MB. Frequenze di campionamento più elevate possono essere necessarie, ad esempio, per registrare artefatti di stimolo o attività multi-unità. Per osservare solo i potenziali di campo, utilizzare un filtro passa-basso sotto tensione a 300 Hz per interrompere l'attività di più unità.
- Determina l'intensità dello stimolo.
- Nel software di controllo dello stimolo, utilizzare il pannello principale per progettare una durata dell'impulso di corrente positiva-negativa bifasica quadrata di 100 μs/fase.
NOTA: ATTENZIONE! La stimolazione a corrente continua richiede un impulso di carica bilanciato per evitare di danneggiare l'apparecchiatura.
- Esegui un test di input/output (I/O) veloce per identificare la migliore intensità dello stimolo. Erogare l'impulso di stimolazione progettato al passaggio 3.5.1 a 0,2 Hz o inferiore aggiungendo un intervallo tra impulsi di 5 s o più nella forma appropriata del software di controllo dello stimolo. Nella scheda dell'ampiezza dell'impulso, inserire un'ampiezza iniziale dell'impulso di 100 μA/fase e aumentare di 50 - 100 μA a ogni prova fino a quando la stimolazione non può evocare in modo affidabile eventi di tipo interictale nelle cortecce paraippocampali (controllare i segnali visualizzati dal software di registrazione).
- Modulazione elettrica dell'ictogenesi limbica
- Programmare l'unità di stimolo per fornire il protocollo di stimolazione di interesse. Utilizzare l'ampiezza dello stimolo identificata durante il test I/O.
nota: Il tasso di fallimento delle risposte evocate dovrebbe essere del ≤20 %.
- Dopo l'interruzione della stimolazione, verificare il ripristino della rete alla condizione pre-stimolo registrando almeno 4 scariche ictali (come al punto 3.4).
