1. Costruire un'arena comportamentale e preparare l'hardware per abilitare la stimolazione optogenetica nell'arena comportamentale
- Per costruire un'arena di comportamento priva di luce, costruisci una scatola con una dimensione di 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24" L x 26" H) fatta di lastre acriliche di plexiglass di colore nero (3 mm di spessore) (vedi Tabella dei materiali). I materiali per costruire una scatola del genere dovrebbero essere disponibili nei negozi di ferramenta locali. Posiziona questa scatola su un tavolo nella stanza del comportamento (Figura 1A).
- Montare una telecamera CCD (Charge-Coupled Device) USB (Universal Serial Bus) 3.0 monocromatica dotata di un filtro a infrarossi (IR) passa-lungo da 830 nm e di un obiettivo C-Mount F1.4 da 8 mm (vedere la tabella dei materiali) al centro del soffitto della scatola nera. Posizionare due strisce di diodi a emissione di luce (LED) a infrarossi (vedere la Tabella dei materiali) sul piano del tavolo per illuminare le larve nell'arena buia (Figura 1A).
- Per costruire la piattaforma LED, procurarsi una piastra quadrata in alluminio da 22 cm × 22 cm (preferibilmente verniciata a spruzzo con finitura nera opaca per eliminare eventuali riflessi). Al centro della piastra, utilizzando un taglierino metallico, praticare un foro abbastanza grande da adattarsi alla telecamera CCD.
- Coprire la piastra metallica con strisce luminose a LED rosse (vedi Tabella dei materiali). Saldare i fili della striscia luminosa a LED in serie e inserire i fili della striscia in un relè optoaccoppiatore controllato da un microprocessore Raspberry Pi 2B (vedere la tabella dei materiali) (Figura 1B e 2).
- Installa e configura il sistema operativo basato su Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux sul processore Raspberry Pi prima di collegare il relè dell'accoppiatore ottico alle strisce LED. Collegare un alimentatore per alimentare le strisce LED e l'accoppiatore ottico (Figura 2) (vedi Tabella dei materiali). Montare la piattaforma LED attorno alla telecamera CCD (Figura 1B).
nota: Il sistema operativo Ubuntu Mate v16.04 è disponibile gratuitamente. Un insieme di semplici comandi basati su Python può essere facilmente adattato per programmare modelli di stimoli luminosi LED (vedi file di sintassi).
- Garantire un'irradianza omogenea in vari punti dell'arena del comportamento. Misurare l'irraggiamento assoluto sulla superficie dell'arena con l'aiuto di uno spettrometro e determinarlo a ~1,3 W/m2 su tutta la superficie dell'arena.
nota: A questa intensità, non sono stati osservati cambiamenti significativi nella temperatura nel corso degli esperimenti. Un altro studio ha utilizzato un irraggiamento più elevato di ~1,9 W/m2 e non ha osservato cambiamenti di temperatura nel corso degli esperimenti.
2. Preparazione delle larve di Drosophila per l'analisi del comportamento
- Mantenere le mosche con cibo per mosche standard (vedi Tabella dei materiali) a 25 °C, 50-60% di umidità relativa (RH) e un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore.
- Al fine di esprimere CsChrimson in una singola coppia di ORN, incrociare femmine vergini da una linea UAS-IVS-CsChrimson con maschi da una linea OrX-Gal4 ('X' corrisponde a uno dei 21 geni del recettore dell'odore larvale (OR) che sono espressi in modo univoco in ciascuna delle 21 coppie di ORN).
- In alternativa, al fine di esprimere CsChrimson in tutti i 21 ORN larvali, incrociare femmine vergini da una linea UAS-IVS-CsChrimson con maschi da una linea Orco-Gal4 ('Orco' è il co-recettore che è espresso in tutti i 21 ORN).
- Utilizzare la linea UAS-IVS-CsChrimson da sola come controllo in questi esperimenti.
nota: Gli stock di mosche qui elencati sono tutti disponibili presso il Bloomington Drosophila Stock Center (vedi Tabella dei materiali).
- Una volta che i maschi e le femmine in un incrocio sono stati lasciati accoppiare e deporre le uova per 48 ore, trasferire gli adulti in una fiala fresca.
- Sulla superficie del flaconcino di cibo contenente uova, aggiungere 400 μL di una miscela contenente 400 μM di all-trans retinal (ATR) disciolti in dimetilsolfossido (DMSO) e 89 mM di saccarosio disciolto in acqua distillata.
nota: La piccola quantità di saccarosio favorisce l'alimentazione larvale della soluzione ATR. L'ATR è un cofattore necessario per l'upregolazione dell'espressione di CsChrimson. L'ATR è sensibile alla luce.
- Una volta aggiunto l'ATR alle fiale di cibo contenenti uova, incubare le fiale al buio per ulteriori 72 h.
NOTA: Sebbene questo studio e i due studi precedenti non abbiano osservato effetti sul comportamento larvale dovuti all'alimentazione con ATR, si raccomanda di controllare gli effetti dell'alimentazione con ATR sottoponendo le linee di prova alla stessa quantità della miscela di cui sopra che non contiene ATR.
- Estrarre le larve di terzo stadio (~120 ore dopo la deposizione delle uova) dalla superficie del cibo per mosche facendole galleggiare utilizzando una soluzione di saccarosio ad alta densità (15%). Utilizzando una micropipetta P1000, separare le larve che galleggiano sulla superficie della soluzione di saccarosio in un becher di vetro da 1000 mL.
- Lavare le larve 3-4 volte scambiando ogni volta 800 ml di acqua distillata fresca nel becher di vetro. Lasciare riposare le larve per 10 minuti prima di sottoporle al test comportamentale.
3. Saggio del comportamento
- Mantenere una temperatura (tra 22-25 °C) e un'umidità (tra il 50 e il 60% di umidità relativa) costanti nella stanza di comportamento.
- Preparare il terreno strisciante larvale versando 150 ml di agarosio fuso (1,5%) in una capsula di Petri quadrata di 22 cm x 22 cm. Viene versata una capsula di Petri per ogni prova del saggio, 8-10 prove per esperimento. Lasciare solidificare e raffreddare l'agarosio per 1-2 ore nelle piastre di Petri prima di utilizzarle nel test del comportamento.
- Trasferire non più di 20 delle larve di terzo stadio preparate al centro della capsula di Petri (Figura 1C). Coprire la capsula di Petri con il coperchio. Posizionare la capsula di Petri nell'arena del comportamento sotto la telecamera CCD.
nota: A seconda dell'esperimento, i saggi comportamentali vengono in genere eseguiti per 3-5 minuti. Se nel test viene utilizzato un odorizzante per fornire indicazioni di orientamento, è stato osservato che il gradiente di odore risultante rimane stabile per circa 5 minuti. Si sconsigliano tempi di analisi più lunghi. Effetti deleteri sulle larve dovuti alla disidratazione o all'esposizione prolungata alla luce rossa a 630 nm non sono stati osservati entro questi punti temporali.
- Accendi la sorgente luminosa a LED a infrarossi da 850 nm per visualizzare le larve nel video. Avviare la telecamera CCD per registrare il movimento larvale.
- Utilizzando il software associato al processore Raspberry Pi, programmare la procedura per somministrare modelli appropriati di stimolazione della luce rossa.
nota: Un insieme di semplici comandi basati su Python può essere facilmente adattato per programmare modelli di stimoli luminosi LED (vedi file di sintassi).
