Inibizione mediata da microRNA delle correnti postsinaptiche eccitatorie nelle fette di ippocampo di topo

Abstract

Fonte: Thalhammer, A., et al. Combinazione di optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del knockdown genico sulla funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatti. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra l'inibizione mediata da microRNA delle correnti sinaptiche eccitatorie in fette di cervello ippocampale di topo. I neuroni CA3 sono stati infettati con un vettore virale ricombinante che ospita un costrutto per esprimere un reporter fluorescente, un canale di membrana attivato dalla luce e un microRNA che riduce l'espressione dei canali del calcio voltaggio-dipendenti. Dopo aver posizionato una fetta in una camera di registrazione e aver patchato un neurone CA1 con una pipetta di registrazione, sono stati utilizzati impulsi luminosi per stimolare il canale attivato dalla luce, provocando un afflusso di ioni e generando un potenziale d'azione. L'assenza di canali del calcio voltaggio-dipendenti nei neuroni CA3 inibisce il rilascio di neurotrasmettitori, causando l'inibizione delle correnti postsinaptiche eccitatorie nei neuroni CA1 connessi sinapticamente.

Protocollo

1. Valutazione del ruolo delle proteine presinaptiche nei circuiti neuronali intatti mediante stimolazione mirata di neuroni abbattuti con l'optogenetica

NOTA: Il seguente protocollo richiede una precedente esperienza con registrazioni elettrofisiologiche in sezioni cerebrali acute e l'accesso a una configurazione elettrofisiologica.

1. Iniettare stereotassicamente nel cervello il virus adeno-associato ricombinante con i sierotipi a mosaico 1 e 2 (rAAV1/2). Determinare le coordinate stereotassiche per la regione cerebrale di interesse utilizzando atlanti stereotassici per il cervello di topo o ratto.
   1. Utilizzare un estrattore per micropipette per estrarre micropipette per iniezione con gambi lunghi di Ø 7-9 μm; agganciare le micropipette per iniezione sui gambi con le forbici. Utilizzare un pennarello sottile e carta millimetrata per posizionare i segni di calibrazione sulle micropipette per iniezione ogni 2 mm.
   2. Anestetizzare l'animale con isoflurano e fissarlo nell'apparato stereotassico.
   3. Mantenere l'animale al caldo durante l'operazione con un termoforo impostato a 37 °C.
   4. Proteggere gli occhi con lubrificante oculare.
   5. Rasare il pelo della testa con un rasoio elettrico.
   6. Stendere lo iodio povidone sulla testa rasata usando un batuffolo di cotone.
   7. Sotto un microscopio da dissezione, praticare un'incisione sulla linea mediana.
   8. Pulire la superficie del cranio con un batuffolo di cotone, in modo da rendere visibili la bregma e la lambda.
   9. Posizionare la micropipetta per iniezione nel suo supporto. Fissare il supporto al braccio stereotassico.
   10. Determinare le coordinate x e y del sito di iniezione rispetto alla bregma e/o alla lambda.
   11. Usa un trapano per assottigliare il cranio sull'area bersaglio.
       nota: Usa movimenti circolari delicati ed evita di perforare il cranio in quanto ciò danneggerebbe la superficie del cervello.
   12. In caso di sanguinamento, assorbire il sangue in eccesso con carta assorbente.
       nota: Un eccesso di sangue renderà difficile determinare correttamente la coordinata z.
   13. Caricare ≤2 μL di virus nella micropipetta per iniezione mediante azione capillare.
   14. Portare la micropipetta per iniezione alle coordinate x e y del sito di iniezione.
   15. Calcola la coordinata z dalla dura madre e abbassa lentamente la pipetta nel cervello.
   16. Quando viene raggiunta la coordinata z, attendere 3 minuti per consentire la regolazione dei tessuti.
   17. Applicare una bassa pressione positiva utilizzando una siringa da 1 mL collegata tramite un tubo flessibile al retro della micropipetta per iniezione. Monitorare visivamente la velocità di espulsione del virus dalla micropipetta per iniezione attraverso il microscopio di dissezione e utilizzando i segni di calibrazione come punti di riferimento.
       nota: Il virus deve essere iniettato a bassa velocità (<100 nL/min) per evitare danni ai tessuti.
   18. Al termine dell'iniezione, attendere 5 minuti, prelevare la micropipetta per iniezione di 0,2 mm, attendere altri 5 minuti, per evitare il riflusso del virus.
   19. Estrarre la micropipetta per iniezione lentamente e completamente dal cervello e gettarla in un contenitore pieno di candeggina.
   20. Bagnare il cranio con soluzione fisiologica e suturare la pelle con 3-4 punti.
   21. Applicare l'unguento alla gentamicina sulla ferita.
   22. Alloggiare l'animale in una gabbia pulita con pellet di cibo e sotto una lampada termica fino a quando non si riprende completamente.
2. ≥15 giorni dopo l'iniezione, decapitare gli animali in anestesia profonda con isoflurano.
3. Preparare fette cerebrali acute della regione cerebrale di interesse con un vibratomo utilizzando una soluzione gassosa (95% O₂, 5% CO₂) ghiacciata di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF), contenente (in mM): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH₂PO₄, 1,5 MgCl₂, 1 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 2 piruvato di sodio e 18 glucosio (osmolarità regolata a 300 mOsm). Ad esempio, se l'obiettivo è analizzare la trasmissione sinaptica dai neuroni piramidali CA3 a quelli CA1, preparare fette sagittali della formazione ippocampale (350 μm di spessore).
   nota: Da questa fase in poi lavorare in condizioni di scarsa illuminazione per evitare l'attivazione della sonda optogenetica da parte della luce ambientale.
4. Lasciare riposare le fette per 30 minuti a 37 °C nello stesso aCSF in una camera progettata per contenere fette di cervello. Conservare le fette nella stessa camera di taglio del cervello a temperatura ambiente fino alla registrazione.
   nota: Utilizzando queste condizioni, le fette possono essere mantenute sane fino a 6-8 ore.
5. Trasferire una fetta in una camera di registrazione sommersa e superfonderla con 2 mL/min dello stesso aCSF utilizzato per il recupero integrato con 1,5 mM di CaCl₂ (Ca²⁺ totale: 2,5 mM) e senza piruvato di sodio.
   nota: Le fette vengono preparate e mantenute a bassa concentrazione di Ca²⁺ (1 mM) per ridurre al minimo la tossicità. Le registrazioni vengono eseguite in 2,5 mM Ca²⁺ per favorire il rilascio delle vescicole.
6. Controllare brevemente il segnale del reporter fluorescente espresso (ad es. TdTomato; Figura 1B) per accertare la localizzazione e l'intensità dell'infezione.
7. Riempire un elettrodo patch con una soluzione intracellulare contenente (in mM): 110 K-gluconato, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N',N'-tetraacetico (EGTA), 3 MgCl₂, 4 adenosina 5′-trifosfato sale di magnesio (Mg-ATP), 0,5 guanosina 5'-trifosfato sale trisodico (Na_3-GTP), 20 K₂-creatina fosfato, tampone acido 10 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico aggiustato con KOH (HEPES-KOH, pH 7,28, 290 mΩ).
   nota: Utilizzare un elettrodo patch con una resistenza della pipetta di 5-6 mΩ.
8. Sotto l'illuminazione a infrarossi, raggiungi una configurazione di intere cellule a tenuta stagna da un neurone che riceve input sinaptici dai neuroni infetti. Ad esempio, se i neuroni piramidali CA3 sono stati infettati, rattoppare i neuroni piramidali nel tratto prossimale e mediale della regione CA1 (Figura 1C).
   nota: La resistenza in serie può essere lasciata non compensata, ma deve essere costante e bassa (≤20 MΩ).
9. Utilizzare la farmacologia per isolare le correnti sinaptiche oggetto di indagine. Ad esempio, se l'obiettivo è quello di studiare la trasmissione sinaptica eccitatoria, bloccare la trasmissione sinaptica inibitoria con 10 μM di bicucullina.
10. Evocano correnti sinaptiche, ad esempio correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC), utilizzando un laser blu a 473 nm accoppiato a una fibra ottica (Ø ≤250 μm) posizionata sui somati dei neuroni infetti (es. CA3 neuroni piramidali).
    1. Regolare la lunghezza della stimolazione al minimo, per ridurre la possibilità di evocare più di un potenziale d'azione per impulso luminoso. Se si utilizza ChETA, impostarlo su 2 ms.
    2. Regolare la forza di stimolazione del laser per produrre correnti sinaptiche piccole ma chiaramente rilevabili (ampiezza di picco di ≤50 pA per le EPSC registrate con un potenziale di mantenimento di -70 mV tra i neuroni piramidali CA3 e CA1; Figura 1D). Se si utilizza ChETA e una fibra ottica di 250 μm di diametro, dovrebbero essere adatte forze di stimolazione di 1-3 mW all'uscita della fibra.
       NOTA: se la potenza del laser non può essere regolata, utilizzare filtri a densità neutra.
    3. Illumina la luce laser a 473 nm sui somati dei neuroni infetti, ma non sui loro assoni. Ad esempio, puntare la luce sui somati CA3 e lontano dai collaterali di Schaffer, per evitare la depolarizzazione diretta degli assoni.
    4. Applicare tetrodotossina (TTX; 0,5 μM), un bloccante dei canali del sodio, al campione per confermare che i canali sono guidati dal potenziale d'azione.
    5. In diverse registrazioni, applicare un bloccante selettivo alla corrente sinaptica in esame per confermare che la stimolazione è selettiva.
       nota: Ad esempio, applicare la 2,3-diosso-6-nitro-7-sulfamoil-benzo[f]chinossalina (NBQX, 10 μM) alle EPSC mediate dal recettore del glutammato del tipo α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionico (AMPA).
    6. Confrontare le correnti sinaptiche evocate otticamente ed elettricamente nella stessa fetta acuta del cervello in risposta a stimoli ripetitivi (stimoli ≥2 a ≤20 Hz). Un grado simile di facilitazione sinaptica o depressione dovrebbe essere osservato tra la stimolazione elettrica e quella ottica quando si utilizza un microRNA di controllo (miR), suggerendo così che meccanismi cellulari simili sono attivati dai due tipi di stimolazioni><. nota: I passaggi di cui sopra sono necessari per garantire che la stimolazione ottica non induca una depolarizzazione diretta dei bottoni presinaptici, bypassando così alcuni meccanismi di trasmissione sinaptica.

Risultati

Figura 1. Valutazione del ruolo di Ca_v2.1[EFa] e Ca_v2.1[EFb] nell'ippocampo nativo mediante stimolazione mirata di neuroni abbattuti con optogenetica. (A) Schema della cassetta di espressione dei costrutti rAAV utilizzati per l'infezione in vivo. (B) Sezione dell'ippocampo che mostra che la fluorescenza di TdTomato è limitata alla regio...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fette di cervello Precamera	Apparato di Harvard	BSC-PC
Imager basato su telecamera CCD	Bio-Rad	ChemiDoc™ MP
Reagenti per colture cellulari	Tecnologie per la vita
trapano	Prudenza	K.1030
EGTA	sigma	E4378
Unguento alla gentamicina	Farmacia locale
glucosio	sigma	G7021
HEPES	sigma	Codice: 54459
Micropipette per iniezione	Narishige	GD1
Sali inorganici e detergenti	sigma
K2-creatina fosfato	Calbiochem	237911
KGluconato	Fluka	Codice 60245
laser	Tecnologie Laserglow	LRS-0473-GFM-00100-03
membrana	Amersham	Protran™ 0,2 μm NC
MgATP	sigma	Visualizzazione del materiale A9187
Porta micropipette	Narishige	IM-H1
Estrattore per micropipette	Narishige	PC-100
Na3GTP	sigma	G8877
NaPiruvato	sigma	P5280
Lubrificante oculare	Farmacia locale	Lacrigel
Iodio povidone	Farmacia locale	Betadina
Apparato stereotassico	WPI
Tetrodotossina	Tocris	Codice: 1069	Tossico
Vibratomo	Leica	VT1200S