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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Caricamento del colorante di calcio
- Selezionare i coloranti di calcio in base alle preferenze del singolo ricercatore. Qui usiamo Fluo-8AM o Fluo-4AM. Tuttavia, questo metodo può essere applicato anche ad altri coloranti: sciogliere i coloranti di calcio in DMSO in una soluzione di 1 mM e copolimeri a blocchi all'1% (ad esempio, acido pluronico-127) fino a un volume finale di 50 μl e sonicare per 10 minuti.
- Aggiungere la soluzione all'aCSF fino a una concentrazione finale di 10 μM, copolimeri a blocchi allo 0,01% per fette di cervello.
- Per gli animali adulti, (>12 settimane), pipettare i coloranti (50 μl) direttamente sulle fette di cervello e mantenere per 75 minuti per consentire una migliore penetrazione del colorante negli strati profondi.
- Per garantire un'adeguata ossigenazione della fetta sommersa durante l'incubazione del colorante, preparare una camera di carico in vetro con coperchio chiuso (barattolo circolare di diametro 2,5 cm, altezza 3,5 cm) con coloranti di calcio diluiti in 2,5 mL di aCSF. Ossigenare continuamente con il 95% di O2/5% di CO2. Non fare bolle.
- Dopo il caricamento del colorante, lavare il tessuto con aCSF e trasferirlo nel sistema di incubazione, riducendo lentamente la temperatura a 15 - 16 °C fino a quando non è pronto per l'uso sperimentale.
2. Registrazioni elettrofisiologiche e imaging
- Posizionare il tessuto in una camera di registrazione sommersa al microscopio e perfondere con aCSF ossigenato a una velocità di flusso di 4 - 5 mL/min a temperatura RT (~22 °C) o fisiologica (~35 °C). Tieni il fazzoletto in posizione usando un'"arpa" su misura, fatta di fili di nylon o d'oro tesi e incollati su un pezzo a forma di U di filo d'oro o platino.
- Per l'elettrofisiologia:
- Preparare pipette di registrazione da vetro borosilicato da 1,5 mm (1,19 mm ID) utilizzando un estrattore per micropipette per ottenere una resistenza finale di 5-6 MΩ.
- Riempire la pipetta con 3 - 4 μl di soluzione interna e visualizzare le cellule sotto contrasto interferenziale differenziale a infrarossi (IR-DIC) utilizzando una telecamera CCD. La soluzione intracellulare deve essere attentamente adattata a ciascun esperimento per ottenere risultati sperimentali.
- Posizionare la pipetta mantenendo la pressione positiva applicata attraverso una porta di aspirazione sul supporto della pipetta sulla membrana di una cellula utilizzando un micromanipolatore. Non è necessario alcun raschiamento preliminare della membrana poiché l'ILM è stato rimosso dalla retina. Una volta che la pipetta è sulla cellula, applicare una leggera pressione negativa sulla pipetta per ottenere una tenuta gigaohm. Quindi, rompere la membrana cellulare con una breve quantità di pressione negativa.
- Effettuare registrazioni di corrente o voltage-clamp su intere celle utilizzando tecniche standard, a seconda dei casi.
- Imaging del calcio:
- Per una singola lunghezza d'onda di eccitazione di Fluo-4, filtrare la luce di eccitazione attraverso un filtro passa-banda da 460 - 490 nm e la luce emessa attraverso un filtro passa-banda da 515 - 550 nm. Usa una fotocamera digitale ad alta velocità per la registrazione più veloce e sensibile. Acquisire le immagini in base alle esigenze.
- Misura le alterazioni della fluorescenza in funzione del tempo a una singola lunghezza d'onda (Fluo-4).