Test di connessioni monosinaptiche utilizzando canali del sodio resistenti alla tetrodotossina e alla tetrodotossina

Abstract

Fonte: Zhang, X. et al., Esame delle connessioni monosinaptiche in Drosophila utilizzando canali del sodio resistenti alla tetrodotossina. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra il test delle connessioni monosinaptiche utilizzando una mosca transgenica. Il moscerino ha canali del sodio resistenti alla tetrodotossina e canali attivati dalla luce rossa nei suoi neuroni presinaptici, che sono optogeneticamente eccitati per trasmettere segnali ai neuroni postsinaptici.

Protocollo

1. Prepara le mosche e identifica le linee promotrici GAL4

1. Selezionare una linea di promotore GAL4 e incrociarla con mosche portatrici sia del transgene UAS-NaChBac che di un transgene optogenetico per l'attivazione.
   nota: UAS-CsChrimson è stato scelto per la sua elevata conduttanza e la facilità con cui attiva i potenziali d'azione mediati dal canale del sodio resistente alla tetrodotossina (TTX) (NaChBac). Sia UAS-NaChBac che UAS-CsChrimson sono disponibili nel Bloomington Stocks Repository.
2. Preparare all-trans retinal come soluzione madre in etanolo (35 mM) e conservare la soluzione in congelatore a -20....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
UAS-csChrimson	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	Codice: 55135	Usato come attivatore neurale
UAS-NaChBac	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	Codice: 9466	Eccitabilità dei resotores nelle cellule in TTX
Tetrodotossina	Tochris	Codice: 1078	Potrebbe essere necessaria un'autorizzazione speciale per l'acquisto di TTX in quanto si tratta di una sostanza controllata
tutti trans-retinici	Sigma-Aldrichall trans-retinico	R2500	Richiede cofattore per la canalrodopsina
Lamiera di acciaio inossidabile 321 saldabile, 0,002" di spessore, 10" di larghezza	McMaster Carr	3254K7	Utilizzato per realizzare portamosche personalizzato. La pellicola personalizzata può essere tagliata al laser pololu.com dal file PDF fornito
Microscopio per dissezione	Zeiss	Stemi 2000-C	Utilizzato per la dissezione della preparazione
Waxer	Almore	Eectra Waxer 66000	Utilizzato durante la dissezione per fissare la mosca in un foglio
Paraffina	Joann	4917217	Utilizzato con la ceretta
Pinza numero 5	Strumenti per la scienza	#5CO	Utilizzato per la dissezione e la guaina
Forbici da dissezione	Strumenti per la scienza	Codice 15001-08	Utilizzato per rimuovere parti della cuticola durante la dissezione
Filo di tungsteno	Sistemi A-M	Codice 797500	Utilizzare con l'elettrolisi per realizzare aghi affilati per la dissezione
Pompa peristaltica circolante	Semplicemente pompe (Amazon)	PM200S	per TTX a ricircolo
Regolatore di velocità per pompa peristaltica	Zitrades (Amazon)	N/A	Controller dimmer PWM per luci a LED o nastro, 12 Volt 8 Amp, interruttore luce a luminosità regolabile Dimmer Controller DC12V 8A 96W per striscia luminosa a led B
Regolatore di precisione per aria compressa Versa-Mount	McMaster Carr	1804T1	Per applicare una pressione positiva durante il patching
Capari in vetro	Strumenti di precisione mondiali	TW150F-3	Per pipette per cerotti
Misuratore multiuso	McMaster Carr	Codice 3846K431	Manometro per regolatore di pressione
Telecamera per elettrofisiologia	Dage MTI	IR-1000	Qualsiasi telecamera che funzioni nella gamma IR (850 nm) funzionerà. Non si desidera utilizzare l'illuminazione rossa in quanto ciò può attivare csChrimson
LED IR	Thorlabs	Motore M850F2	Per l'illuminazione obliqua
Fibra ottica per LED IR	Thorlabs	Codice: M89L01	Coppie a LED IR
obiettivo	Olimpo 40X	LUMPlanFLN	Questo può essere utilizzato sulla maggior parte delle microscienze e funziona bene per visualizzare i neuroni delle mosche.
LED ambra	Thorlabs	Codice: M590L3D	Per la visualizzazione di RFP e mCherry
LED blu	Thorlabs	Codice: M470L3D	Per la visualizzazione della GFP
Set di filtri GFP	Chroma	Numero 49011	Per visualizzare la GFP o stimolare il canale2rodopsina
Set di filtri mCherry personalizzati	Chroma	ET580/25X e T600LPXR (dal set 49306) ma con un'ottica di barriera/emissione ET610LP	Utilizzare solo se si desidera applicare patch ai neuroni identificati con channel2rhodopsin
Dicroico per combinare LED ambra e blu	Thorlabs	DMLP550R	Utilizzare solo il cerotto sotto mCherry ed eccitare la rodopsina channel2 con luce blu.
LED rosso	LEDSupply	Cree XPE 620 - 630 nm	Usato per guidare csChrimson
Driver LED	LEDSupply	3021-D-E-1000	Utilizzato per pilotare i LED per la stimolazione optogenetica
manipolatore	Strumenti Sutter	MP-225	Utilizzato per posizionare la pipetta durante le registrazioni
Amplificatore Patchclamp	Sistemi A-M	Modello 2400	È adatto un amplificatore equivalente
Filtro Bessel	Strumenti Warner	LPF 202A	Filtro ausiliario utilizzato per filtrare la traccia di corrente all'oscilloscopio durante il patching.
Sistema di acquisizione dati	Strumenti nazionali	NI PCIe-6321 781044-01	Utilizzato per registrare i dati dall'amplificatore al computer
Blocco connettore - Terminale BNC BNC-2090A	Strumenti nazionali	Codice: 779556-01	Utilizzato per collegare l'amplificatore alla scheda DAQ.
Lamina d'acciaio	McMaster Carr	3254K7	Lamina d'acciaio per camera di registrazione personalizzata
Magneti	K&J Magnetics	D42	Per fissare la camera di registrazione al supporto ad anello
1/16" Cell Cast Acrilico Trasparente	Pololu		Utilizzato per creare camere di registrazione personalizzate. L'acrilico può essere tagliato al laser pololu.com dal file PDF fornito