Test di connessioni monosinaptiche utilizzando canali del sodio resistenti alla tetrodotossina e alla tetrodotossina

Abstract

Fonte: Zhang, X. et al., Esame delle connessioni monosinaptiche in Drosophila utilizzando canali del sodio resistenti alla tetrodotossina. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra il test delle connessioni monosinaptiche utilizzando una mosca transgenica. Il moscerino ha canali del sodio resistenti alla tetrodotossina e canali attivati dalla luce rossa nei suoi neuroni presinaptici, che sono optogeneticamente eccitati per trasmettere segnali ai neuroni postsinaptici.

Protocollo

1. Prepara le mosche e identifica le linee promotrici GAL4

1. Selezionare una linea di promotore GAL4 e incrociarla con mosche portatrici sia del transgene UAS-NaChBac che di un transgene optogenetico per l'attivazione.
   nota: UAS-CsChrimson è stato scelto per la sua elevata conduttanza e la facilità con cui attiva i potenziali d'azione mediati dal canale del sodio resistente alla tetrodotossina (TTX) (NaChBac). Sia UAS-NaChBac che UAS-CsChrimson sono disponibili nel Bloomington Stocks Repository.
2. Preparare all-trans retinal come soluzione madre in etanolo (35 mM) e conservare la soluzione in congelatore a -20 °C.
3. Mescolare 28 μL di questo brodo in circa 5 mL di cibo reidratato per fiocchi di patate e aggiungere questa miscela alla parte superiore di una fiala di terreno convenzionale di Drosophila.
4. Allevare mosche adulte che esprimono csChrimson su cibo contenente 0,2 mM di all-trans-retinal per 1-3 giorni.

2. Prepara le azioni TTX

1. Creare una soluzione madre di 1 mM di TTX in acqua distillata o deionizzata. Conservare questa soluzione in un frigorifero da laboratorio per diversi mesi. Controlla le politiche dell'istituto in merito allo stoccaggio di TTX, poiché molte istituzioni classificano il TTX come sostanza pericolosa o controllata.

3. Prepara le mosche per l'elettrofisiologia

1. Raccogli mosche adulte di 1-3 giorni che vengono allevate con il cibo con all-trans-retinal.
2. Metti le mosche in una fiala di vetro scintillante. Metti la fiala sul ghiaccio per 1 minuto per immobilizzare le mosche.
3. Usa una pinza grossolana per inserire una mosca in una camera di registrazione su misura. La camera è costituita da un cerchio da 3 1/2" tagliato al laser da 1/16" di acrilico. Taglia un foro da 3/4" al centro, dove è attaccata una pellicola personalizzata con resina epossidica in 2 parti. La pellicola contiene una speranza di forma triangolare in cui viene inserita la mosca.
4. Applicare cera o resina epossidica polimerizzabile ai raggi ultravioletti (UV) intorno all'animale per fissarlo saldamente all'interno della camera di registrazione.
5. Illuminare la preparazione con una fibra ottica a collo d'oca per la visualizzazione al microscopio. Imposta le fibre del collo d'oca per l'illuminazione obliqua regolandole in modo che illuminino la mosca direttamente dal lato.
6. Regolare il livello di luce al minimo possibile per consentire comunque una chiara visualizzazione della mosca. Questa intensità luminosa varierà tra i singoli esperimenti.
   nota: Questo protocollo può essere adattato utilizzando un metodo di espiantazione cerebrale in situ.
7. Recupera la soluzione salina di registrazione esterna. La soluzione salina contiene in mM: 103 cloruro di sodio, NaCl, 3 cloruro di potassio, KCl, 5 acido N-tris(idrossimetil)metil-2-amminoetano-solfonico, 8 trealosio, 10 glucosio, 26 bicarbonato di sodio, NaHCO₃, 1 fosfato monobasico di sodio, NaH₂PO₄, 1,5 cloruro di calcio, CaCl₂ e 4 cloruro di magnesio, MgCl₂ (aggiustato a 270-275 mΩ). La soluzione salina è bollita con il 95% di O₂/5% di CO₂ (carbogena) e ha un pH regolato a 7,3.
8. Metti 4-6 gocce di soluzione salina per la registrazione extracellulare sulla preparazione della mosca. A questo punto, aumentare il livello di luce al microscopio di dissezione per una migliore visibilità.
9. Affilare un filo di tungsteno usando l'elettrolisi. Per realizzare il filo, preparare una soluzione satura di nitrato di potassio, KNO₃ e applicare circa 20 V di corrente alternata (CA) immergendo la punta del filo nella soluzione 20 volte per 100 ms ciascuna fino a quando la punta non è affilata. Usa il filo di tungsteno affilato per rimuovere la cuticola sulla testa della mosca e quindi esporre il cervello.
10. Esponi ulteriormente il cervello rimuovendo la trachea e i corpi adiposi che lo circondano. Se si accede ai lobi delle antenne, utilizzare un filo di tungsteno piegato o uno strumento simile per infilare delicatamente le antenne sotto la camera di registrazione a lamina per aumentare la visibilità. Utilizzare una pinza affilata per strappare delicatamente la guaina gliale che copre l'area di interesse in cui verranno effettuate le registrazioni.
11. Trasferire la camera di registrazione nell'impianto di elettrofisiologia. Iniziare immediatamente la perfusione con soluzione salina di registrazione esterna bollita con carbogeno per preservare il cervello. Il serbatoio della soluzione salina è posizionato sopra il tavolino del microscopio e viene alimentato per gravità verso la preparazione. Utilizzare una linea per il vuoto e un pallone Erlenmeyer da 2 L per raccogliere la soluzione salina di scarto.

4. Ottieni la registrazione dell'intera cella

1. Estrarre le pipette per cerotti su un estrattore per pipette commerciale. Consultare il manuale per le impostazioni necessarie per ottenere una pipetta appropriata con una resistenza del puntale vicina a 7 mΩ.
2. Aggiungere 4 μl di soluzione di registrazione interna in una pipetta per patch. La soluzione salina interna è costituita da 140 aspartato di potassio, 10 acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico (HEPES), 4 adenosina trifosfato di magnesio (MgATP), 0,5 guanosina 5'-trifosfato sale trisodico idrato (Na₃GTP), 1 acido etilenglicole tetraacetico (EGTA) e 1 cloruro di potassio (KCl) in mM.
3. Configura l'amplificatore patch clamp per la registrazione di intere celle. Azzerare l'offset dell'amplificatore e impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova. In questo caso, viene utilizzato un amplificatore Patch clamp 2.400 di sistemi AM.
4. Applicare una pressione positiva attraverso la pipetta e avvicinarsi alla cellula. Utilizzare un micromanipolatore per dirigere la pipetta e contattare la cellula. Rilasciare la pressione positiva. Impostare il potenziale di tenuta della membrana a -60 mV. La pipetta deve formare una tenuta gigaohm con la membrana della cellula, come evidenziato da una bassa corrente di mantenimento del sub-picoamp.
   nota: Se si utilizza il targeting cellulare guidato dalla proteina fluorescente verde (GFP), cercare di ridurre al minimo l'uso della luce epifluorescente per prevenire l'attivazione di ChR2 e la potenziale depressione sinaptica. Attendere inoltre qualche minuto prima di applicare il passaggio 5.
5. Impostare l'amplificatore in modo che fornisca impulsi di prova da -50 mV a -60 mV. Questa impostazione è standard sugli amplificatori patch-clamp. Gli impulsi di prova riveleranno un grande transitorio capacitivo che rappresenta la corrente necessaria per caricare la pipetta patch. Rimuovere i transitori capacitivi regolando le manopole di compensazione della capacità sull'AM 2400 o simile amplificatore.
6. Applicare brevi impulsi di pressione negativa per rompere la membrana cellulare e ottenere la configurazione dell'intera cellula.
   nota: Una configurazione dell'intera cellula si osserva quando c'è un grande aumento dei transitori capacitivi che mostrano la capacità del neurone. Probabilmente si osserverà anche un piccolo aumento della corrente di mantenimento (linea di base). Impostare l'amplificatore sulla modalità pinza amperometrica e regolare il potenziale della cella da -50 a -60 mV.

5. Testare la connettività sinaptica

1. Configura il sistema di acquisizione dati (DAQ) per attivare un driver a diodi a emissione luminosa (LED) per generare impulsi luminosi. In questo caso, un sistema DAQ di National Instruments viene utilizzato con Matlab per fornire un segnale analogico a un driver LED. L'intensità del LED viene regolata tramite il segnale analogico al driver. Il LED è un LED con lunghezza d'onda 620-630 nm.
2. Posizionare il LED rosso ad alta potenza direttamente sotto il preparato. Regolare l'intensità della luce in modo che 0,238 mW/mm² raggiunga la mosca.
3. Attiva i neuroni presinaptici durante la registrazione dalla cellula postsinaptica di interesse. Ottenere l'attivazione cellulare in modo optogenetico, farmacologico o tramite stimolazione nervosa. Qui vengono applicati csChrimson e brevi impulsi di luce rossa.
   NOTA: Le connessioni sinaptiche possono essere monitorate sia nella pinza amperometrica come potenziali postsinaptici eccitatori (EPSP) che nella pinza di tensione come correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC). Una connessione sinaptica dovrebbe essere visibile prima di applicare TTX in risposta a un impulso luminoso di 40 ms. Se non si osserva alcuna connessione, è improbabile che i neuroni siano connessi sinapticamente sia mono- che polisinapticamente. Il potenziale di tenuta può essere regolato per enfatizzare di conseguenza le connessioni eccitatorie o inibitorie.
4. Se si osserva una connessione in soluzione fisiologica normale, aggiungere TTX al sistema di perfusione per ottenere una concentrazione finale di 1 μM. Utilizzare una pompa di ricircolo per catturare e riutilizzare la soluzione salina per conservare TTX. La pompa peristaltica preleva la soluzione salina dal bagno e la restituisce al serbatoio salino.
5. Regolare la velocità della pompa per fornire un forte vuoto costante che non consenta al livello di soluzione salina nel bagno di salire e scendere.
   nota: L'applicazione di TTX dovrebbe portare alla cessazione dell'attività di spiking nel neurone che viene monitorato nell'intera cellula. Ciò conferma che è stato aggiunto abbastanza TTX alla soluzione salina.
6. Applicare nuovamente brevi impulsi di luce rossa (40 ms per ogni impulso). A questo punto, qualsiasi connessione sinaptica che rimane è probabilmente monosinaptica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
UAS-csChrimson	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	Codice: 55135	Usato come attivatore neurale
UAS-NaChBac	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington	Codice: 9466	Eccitabilità dei resotores nelle cellule in TTX
Tetrodotossina	Tochris	Codice: 1078	Potrebbe essere necessaria un'autorizzazione speciale per l'acquisto di TTX in quanto si tratta di una sostanza controllata
tutti trans-retinici	Sigma-Aldrichall trans-retinico	R2500	Richiede cofattore per la canalrodopsina
Lamiera di acciaio inossidabile 321 saldabile, 0,002" di spessore, 10" di larghezza	McMaster Carr	3254K7	Utilizzato per realizzare portamosche personalizzato. La pellicola personalizzata può essere tagliata al laser pololu.com dal file PDF fornito
Microscopio per dissezione	Zeiss	Stemi 2000-C	Utilizzato per la dissezione della preparazione
Waxer	Almore	Eectra Waxer 66000	Utilizzato durante la dissezione per fissare la mosca in un foglio
Paraffina	Joann	4917217	Utilizzato con la ceretta
Pinza numero 5	Strumenti per la scienza	#5CO	Utilizzato per la dissezione e la guaina
Forbici da dissezione	Strumenti per la scienza	Codice 15001-08	Utilizzato per rimuovere parti della cuticola durante la dissezione
Filo di tungsteno	Sistemi A-M	Codice 797500	Utilizzare con l'elettrolisi per realizzare aghi affilati per la dissezione
Pompa peristaltica circolante	Semplicemente pompe (Amazon)	PM200S	per TTX a ricircolo
Regolatore di velocità per pompa peristaltica	Zitrades (Amazon)	N/A	Controller dimmer PWM per luci a LED o nastro, 12 Volt 8 Amp, interruttore luce a luminosità regolabile Dimmer Controller DC12V 8A 96W per striscia luminosa a led B
Regolatore di precisione per aria compressa Versa-Mount	McMaster Carr	1804T1	Per applicare una pressione positiva durante il patching
Capari in vetro	Strumenti di precisione mondiali	TW150F-3	Per pipette per cerotti
Misuratore multiuso	McMaster Carr	Codice 3846K431	Manometro per regolatore di pressione
Telecamera per elettrofisiologia	Dage MTI	IR-1000	Qualsiasi telecamera che funzioni nella gamma IR (850 nm) funzionerà. Non si desidera utilizzare l'illuminazione rossa in quanto ciò può attivare csChrimson
LED IR	Thorlabs	Motore M850F2	Per l'illuminazione obliqua
Fibra ottica per LED IR	Thorlabs	Codice: M89L01	Coppie a LED IR
obiettivo	Olimpo 40X	LUMPlanFLN	Questo può essere utilizzato sulla maggior parte delle microscienze e funziona bene per visualizzare i neuroni delle mosche.
LED ambra	Thorlabs	Codice: M590L3D	Per la visualizzazione di RFP e mCherry
LED blu	Thorlabs	Codice: M470L3D	Per la visualizzazione della GFP
Set di filtri GFP	Chroma	Numero 49011	Per visualizzare la GFP o stimolare il canale2rodopsina
Set di filtri mCherry personalizzati	Chroma	ET580/25X e T600LPXR (dal set 49306) ma con un'ottica di barriera/emissione ET610LP	Utilizzare solo se si desidera applicare patch ai neuroni identificati con channel2rhodopsin
Dicroico per combinare LED ambra e blu	Thorlabs	DMLP550R	Utilizzare solo il cerotto sotto mCherry ed eccitare la rodopsina channel2 con luce blu.
LED rosso	LEDSupply	Cree XPE 620 - 630 nm	Usato per guidare csChrimson
Driver LED	LEDSupply	3021-D-E-1000	Utilizzato per pilotare i LED per la stimolazione optogenetica
manipolatore	Strumenti Sutter	MP-225	Utilizzato per posizionare la pipetta durante le registrazioni
Amplificatore Patchclamp	Sistemi A-M	Modello 2400	È adatto un amplificatore equivalente
Filtro Bessel	Strumenti Warner	LPF 202A	Filtro ausiliario utilizzato per filtrare la traccia di corrente all'oscilloscopio durante il patching.
Sistema di acquisizione dati	Strumenti nazionali	NI PCIe-6321 781044-01	Utilizzato per registrare i dati dall'amplificatore al computer
Blocco connettore - Terminale BNC BNC-2090A	Strumenti nazionali	Codice: 779556-01	Utilizzato per collegare l'amplificatore alla scheda DAQ.
Lamina d'acciaio	McMaster Carr	3254K7	Lamina d'acciaio per camera di registrazione personalizzata
Magneti	K&J Magnetics	D42	Per fissare la camera di registrazione al supporto ad anello
1/16" Cell Cast Acrilico Trasparente	Pololu		Utilizzato per creare camere di registrazione personalizzate. L'acrilico può essere tagliato al laser pololu.com dal file PDF fornito