Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Fabbricazione degli elettrodi di stimolazione
- Per realizzare un elettrodo di stimolazione, tagliare sei pezzi lunghi 10 cm di fili di collegamento in miniatura, rimuovere 2 cm di rivestimento su un'estremità e 1 cm sull'altra estremità.
- Attorcigliare due cavi insieme e saldarli sul lato più corto sbucciato.
- Acquisisci una striscia di confezione a tre nastri di qualsiasi circuito integrato con il case SOT-353 (Small Outline Transistor-353).
- Cucire i fili intrecciati attraverso i tre fori della confezione. Il segmento più lungo e sbucciato dei fili dovrebbe trovarsi nelle cavità della confezione. Posizionare i cavi in modo che l'estremità dell'isolamento sia in linea con il bordo dei fori.
- Metti il cemento dentale nei fori per fissare i fili.
cautela: Il cemento dentale deve essere sufficientemente denso da evitare perdite nella cavità della confezione.
- Una volta che il cemento si è solidificato (minimo 10 minuti), capovolgere la confezione e mettere un sottile strato di supercolla nel foro per formare una tenuta stagna verso il cemento poroso. Evitare di incollare i fili staccati.
- Attorcigliare i cavi insieme sul lato staccato più corto e saldarli (Figura 1A).
- Afferrare il segmento più lungo e sbucciato dei fili con la punta di una pinzetta sottile, arrotolarli e avvolgerli nelle cavità (Figura 1B). Se necessario, tagliare il cavo in eccesso.
2. Fabbricazione degli elettrodi di registrazione
- Per realizzare un elettrodo a tripletta di registrazione (Figura 1C-D), tagliare un pezzo di tubo di acciaio inossidabile lungo un centimetro utilizzando una sega rotante ad alta velocità. Rimuovere l'aletta dalle estremità del tubo con un ago affilato e assicurarsi che il tubo sia pulito da detriti e completamente permeabile.
nota: Non utilizzare pinze, poiché distorcerebbero il tubo.
- Piega un perno distanziatore per pannelli placcato in oro con una lunghezza minima di 3 cm per formare un supporto a forma di J. Taglia la gamba più lunga della forma a "J" e saldala insieme per ottenere la forma originale per creare un giunto staccabile tra la parte lineare lunga, che sarà trattenuta dal dispositivo stereotassico, e la forma a "U", che terrà l'elettrodo e fungerà da punto di ancoraggio. Incolla insieme il tubo e la gamba più corta del supporto a "J". Incollare altre barre lunghe 1 cm, se necessario, per stabilità.
- Tagliare 3 pezzi di fili di elettrodi lunghi 2,5 cm con forbici ultrafini in acciaio inossidabile. Assicurarsi che il taglio sia netto e netto e che l'isolamento sia intatto sulla superficie circolare del filo dell'elettrodo. Inoltre, assicurarsi che la punta tagliata non sia piegata a causa della forza applicata. Piegare 1 o 2 mm su un'estremità di ciascuno dei fili con angoli diversi (ad esempio, uno dritto a sinistra, uno a 45° e uno ad angolo retto) per renderli distinguibili.
- Riempi il tubo con i fili. Scegliere una spaziatura appropriata degli elettrodi per l'esperimento (ad esempio, per la registrazione del potenziale di campo locale corticale (LFP) e della densità della sorgente di corrente (CSD), la sporgenza consigliata delle punte dei fili dall'apertura del tubo è rispettivamente di 4,5 mm, 4,1 mm e 3,7 mm). Notare quale filo corrisponde a quale profondità per mantenere un corretto ordine dei canali.
- Una volta che i fili si allineano uno accanto all'altro e sono paralleli al tubo, per fissare i fili degli elettrodi, posizionare una singola goccia di supercolla liquida su entrambe le estremità del tubo con un ago affilato. Assicurarsi che la colla scorra nel tubo a causa dell'effetto capillare, ma non verso i siti di registrazione alle estremità sporgenti.
- Predisporre una scheda di interfaccia elettrodo con un apposito microconnettore compatibile con il sistema di registrazione da utilizzare.
- Introdurre le estremità piegate e non registranti dei fili nei fori della scheda di interfaccia dell'elettrodo corrispondenti al canale di registrazione desiderato. Quando tutti i fili sono in posizione, spingere i perni d'oro nei fori con una pinzetta.
nota: I perni d'oro possono essere fissati in posizione utilizzando cemento dentale, ma nella maggior parte dei casi sono abbastanza stabili senza questo passaggio di sicurezza.
3. Anestesia
- Posizionare l'animale in una camera di induzione dell'anestesia sigillata e riempirla con il 4-5% di isoflurano in 2 L/min di aria medica.
- Quando il ratto è sdraiato, rimuovere l'animale dalla camera e posizionarlo in un telaio stereotassico con un nasello di ventilazione appropriato.
- Impostare il livello di isoflurano al 2%, anche se la velocità del flusso d'aria dovrebbe rimanere la stessa. Controllare il livello di anestesia. Se c'è un'assenza del riflesso di ritiro della zampa in risposta al pizzicamento, continuare, altrimenti aumentare la profondità dell'anestesia.
- Monitorare e mantenere la temperatura corporea del ratto a 37 ± 0,5 °C con un sistema di monitoraggio omeotermico. Applicare una goccia di unguento di paraffina sugli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea. Ripetere questa procedura più volte durante l'intervento, se necessario.
- Iniettare per via sottocutanea 0,3 mg/kg di atropina per evitare la formazione di muco nelle vie aeree. Per interventi chirurgici più lunghi, ripetere l'operazione ogni quattro ore. Monitora la respirazione e regola il vaporizzatore, se necessario.
4. Impianto degli elettrodi di stimolazione e registrazione
NOTA: Autoclave tutti gli strumenti chirurgici necessari e seguite attentamente le regole generali di asepsi e antisepsi durante l'intera procedura. Evitare di toccare aree non sterili al di fuori dell'area chirurgica. Immergere gli elettrodi in alcol etilico (70%) per 30 minuti prima dell'impianto.
- Rimuovi la maggior parte dei capelli dal cuoio capelluto con un tagliacapelli. Applicare la crema depilatoria sul cuoio capelluto, stenderla uniformemente sulla superficie e attendere qualche minuto. Utilizzare una spatola per rimuovere delicatamente la crema e i capelli rimanenti. Sciacquare la pelle con acqua, quindi con disinfettante.
- Iniettare lidocaina all'1 - 2% (non superare una dose totale di 7 mg/kg) per via sottocutanea per intorpidire la pelle. Applicare una singola goccia di unguento veterinario per gli occhi (ad es. paraffina).
- Praticare un'incisione sagittale accurata e lunga (~2 cm) sulla linea mediana con un bisturi dalla fronte al collo. Sezionare i tessuti, compreso il periostio, dal cranio. Quindi, utilizzando uno scalpello o una pinzetta per denti, pulire l'area tra le cristae delle due ossa temporali. Ritrarre la pelle sezionata usando quattro bulldog per mantenere il cranio esposto.
- Posiziona delicatamente una pinzetta sottile tra il bordo ripido dell'osso temporale e i muscoli e separali. Fai movimenti di jigging per esporre il più possibile l'ampia superficie dell'osso temporale, preferibilmente dal bordo dell'osso occipitale al piano delle suture coronali, senza danneggiare i muscoli.
- Posizionare i divaricatori bitemporalmente per mantenere esposte le ossa temporali.
- Sciacquare la superficie del cranio con 1 - 2 ml di perossido di idrogeno al 3% (H2O2), quindi lavarlo con 1 - 2 ml di acqua.
- Asciugare all'aria la superficie delle ossa temporali con molta cura, asciugando l'umidità con bastoncini oculari. Verificare se gli elettrodi di stimolazione si adattano alla superficie verticale del cranio pulita (il bordo superiore dell'elettrodo di stimolazione deve essere in linea con il bordo della crista dell'osso temporale). Se necessario, regolare nuovamente i bulldog e i divaricatori o modellare gli elettrodi di stimolazione con le forbici.
- Riempire le cavità degli elettrodi di stimolazione con gel elettroconduttivo e applicare un sottile strato di colla sul bordo degli elettrodi.
- Posizionare l'elettrodo di stimolazione sulla superficie asciutta dell'osso temporale con un movimento preciso e tenerlo saldamente in posizione per un minuto con una pinzetta sottile. Assicurarsi che l'umidità non sia a contatto con la colla. Asciugare con bastoncini oculari, se necessario.
cautela: Se l'elettrodo diventa instabile, rimuoverlo. Dopo aver pulito l'osso, ripetere questo passaggio con un nuovo elettrodo di stimolazione.
- Mettere del cemento dentale sui bordi dell'elettrodo di stimolazione, asciugando continuamente l'umidità che fuoriesce nei tessuti con bastoncini oculari. Quindi, coprire l'intero elettrodo di stimolazione con cemento.
- Dopo che il cemento è completamente indurito, ripetere questi passaggi sul lato controlaterale.
- Praticare dei fori su tutto il cranio per le viti di ancoraggio. Avvita le viti in miniatura nei fori e mettici sopra del cemento dentale. Utilizzare una testa di perforazione di diametro inferiore del ~10% rispetto al diametro della vite.
- A seconda dello scopo degli esperimenti, saldare un connettore alle estremità dei cavi, posizionarlo sulla superficie e coprirlo con cemento, oppure continuare a impiantare gli elettrodi di registrazione e le fibre ottiche, o preparare una finestra cranica sopra il cranio. In quest'ultimo caso, saldare i connettori e ancorarli al costrutto solo all'estremità. In caso di necessità di registrazioni simultanee TES e LFP a lungo termine, impiantare le suddette triplette di elettrodi invece di fili singoli.
nota: Questa configurazione consente la rimozione degli artefatti di stimolazione di modo comune8. Per i dettagli sulla registrazione dell'impianto di elettrodi, vedere i protocolli precedenti.
- Lavare abbondantemente i tessuti esposti con disinfettante. Iniettare per via sottocutanea lidocaina all'1 - 2% (non superare una dose totale di 7 mg/kg).
- Sbrigliare i bordi della ferita e chiuderli con semplici suture interrotte attorno al connettore/impianto. Quindi, disinfettare la ferita con iodio povidone.
- Iniettare 5 mg/kg di carprofene per via sottocutanea. Ripetere l'operazione se necessario.
nota: Possono essere utilizzati altri analgesici, che soddisfino i requisiti stabiliti dal consiglio di autorizzazione etica locale.
- Sospendi l'anestesia, rilascia le barre auricolari e il nasello e metti l'animale in una gabbia di recupero postoperatoria per riprendere conoscenza.
- Assicurarsi che l'animale sia sotto stretta sorveglianza durante le prime ore postoperatorie. Continuare a monitorare periodicamente l'area dell'impianto.
nota: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Ospita l'animale individualmente fino a quando non si riprende completamente dalla procedura.
