1. Fabbricazione di elettrodi di registrazione
- Estrazione degli elettrodi di vetro
- Utilizzare il seguente protocollo per l'estrattore di microelettrodi (vedi Tabella dei materiali):
- Linea 1: Heat 510 Pull - Velocità 30 Tempo 250; Linea 2: Heat 490 Pull - Velocità 30 Tempo 250.
nota: Le unità di tempo corrispondono a 0,5 ms per unità; le altre unità sono relative. Il valore del calore deve essere regolato per ogni filamento dopo aver eseguito il test di rampa.
- Utilizzare un microscopio (ingrandimento 35x) per assicurarsi che il diametro interno dell'elettrodo estratto sia compreso tra 7 e 10 μm (Figura 1A). Conservare i capillari in contenitori ben chiusi per evitare l'accumulo di polvere.
- Lucidatura a fuoco
- Lucidare a fuoco i capillari (80 - 90% del valore calorifico massimo per 1 - 2 s) utilizzando una microforgia (vedi Tabella dei materiali). Assicurarsi che il diametro interno finale dell'elettrodo lucidato sia di 5 μm (Figura 1A).
- Curvatura
NOTA: Vengono praticate due curve per posizionare l'elettrodo sulla parte superiore del muscolo sotto un obiettivo ad alto ingrandimento.
- Utilizzare l'apparecchio mostrato nella Figura 1B. Fissare l'elettrodo nel manipolatore e posizionare la punta sopra il filamento, senza toccarlo.
- Impostare il valore di calore al 60 - 70% del massimo e premere il pedale della microforgia per 1 - 2 s (vedi Tabella dei materiali) per riscaldare il filamento. Utilizzare un ago a forma di L per tirare delicatamente verso il basso la punta dell'elettrodo (Figura 1B ingrandita). Eseguire la curva a circa 90° (Figura 1C).
- Tenere l'elettrodo sulla fiamma della torcia con la mano con una pinza ed eseguire la seconda curva a una distanza di 7 - 10 mm dalla prima curva e con un angolo di circa 120o (Figura 1C).
2. Passaggi preparatori aggiuntivi
- Preparare una soluzione emolinfatica (HL3) (in mM): 70 cloruro di sodio (NaCl), 5 cloruro di potassio (KCl), 20 cloruro di magnesio (MgCl2), 10 carbonato acido di sodio (NaHCO3), 5 trealosio, 115 saccarosio, 5 acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico (HEPES) e 1 mM di cloruro di calcio (CaCl2); regolare il pH a 7,3 - 7,4. Conservate la soluzione in frigorifero e fatela fresca ogni settimana.
- Realizzare le pipette di stimolazione allo stesso modo delle pipette di vetro per la registrazione, tranne per il fatto che non è necessario piegarle.
nota: La preparazione degli elettrodi di stimolazione è descritta in dettaglio in 28 e 27. Il diametro finale dopo la lucidatura a fuoco deve essere compreso tra 5 e 7 μm.
- Inserire una pipetta di stimolazione in un portamicroelettrodi collegato a una siringa.
3. Registrazioni elettriche di correnti giunzionali eccitatorie (EJC)
- registrazione
- Posizionare la capsula di Petri con la preparazione sul tavolino del microscopio (Figura 2). Inserire l'elettrodo di riferimento nella vasca.
- Riempire l'elettrodo di registrazione con la soluzione HL3. Con l'obiettivo 10x (vedi Tabella dei materiali), immergere l'elettrodo nella vasca e posizionarlo sui muscoli 6 e 7 dei segmenti addominali 2, 3 o 4 utilizzando il micromanipolatore (vedi Tabella dei materiali) (Figura 3 A.1 e A.2).
- Cambia l'obiettivo a 60x (vedi Tabella dei materiali). Focalizza l'area di interesse utilizzando l'ottica a epifluorescenza o DIC. Posizionare la punta dell'elettrodo sopra il bottone sinaptico (Figura 3 B.1-3).
- Premere l'elettrodo molto delicatamente sul muscolo. Una pressione eccessiva può danneggiare la giunzione neuromuscolare (NMJ) o indurre un aumento dell'attività sinaptica spontanea. Assicurarsi che la punta dell'elettrodo non sia ostruita: in tal caso, sostituirla.
- Accendere l'amplificatore, la scheda A/D e il computer.
- Scegli la modalità di clamp di tensione sull'amplificatore.
- Avvia il software di acquisizione e scegli la modalità "senza interruzioni".
- Osservare la comparsa di correnti giunzionali eccitatorie in miniatura (mEJC) sullo schermo del computer.
- Assicurarsi che l'ampiezza delle mEJC sia compresa tra 0,2 e 0,7 nA.
nota: EJC più piccole indicano che l'elettrodo di registrazione presenta difetti o che non è posizionato correttamente.
- stimolazione
- Utilizzando un micromanipolatore, sotto controllo visivo, posizionare l'elettrodo di stimolazione vicino all'assone innervando i segmenti addominali 2 - 4.
- Applicare una pressione negativa tirando il pistone della siringa collegata al portaelettrodo in modo che l'assone venga tirato all'interno dell'elettrodo (Figura 2).
- Accendi lo stimolatore. Ruotare la manopola sull'unità di isolamento (vedere Tabella dei materiali) per impostare una corrente zero, quindi aumentarla delicatamente fino a quando non compaiono le EJC (o fino al raggiungimento della soglia).
- Eseguire la stimolazione in un regime soprasoglia, con la corrente di stimolazione aumentata di circa il doppio, rispetto alla soglia per l'osservazione delle EJC.
nota: Nella nostra esperienza, tale intensità di stimolazione è ottimale per evitare fallimenti del potenziale d'azione e l'attivazione del potenziale d'azione. Ad esempio, se le EJC compaiono con una corrente di stimolazione di 0,2 mA, utilizzare una corrente di 0,4 mA durante l'esperimento.
