Tecnica automatizzata di patch clamp guidata da immagini per lo studio dei neuroni nelle fette di cervello

Abstract

Fonte: Wu, Q., et al. Applicazione di patch clamp automatizzato guidato da immagini per lo studio dei neuroni in fette di cervello. J. Vis. Exp. (2017).

In questo video, le fette di cervello sono immobilizzate in una camera di registrazione e le cellule di interesse vengono localizzate e focalizzate utilizzando un microscopio controllato da computer. Il sistema automatizzato di elaborazione delle immagini posiziona quindi con precisione una pipetta patch per sigillare la membrana cellulare e monitorare i segnali elettrici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Configurazione del sistema

1. Costruire l'unità di controllo della pressione.
   1. Montare l'unità di controllo della pressione secondo la mappa del circuito (Figura 1). Saldare le parti necessarie sul circuito stampato (PCB) prodotto secondo gli schemi del circuito elettrico (Figura 1b). Utilizzare resistori standard, LED (diodi a emissione di luce), transistor a effetto di campo (MOSFET) a semiconduttore di ossido di metallo, condensatori e connettori. Saldare le elettrovalvole sul circuito stampato (circuito stampato). Collegare la pompa dell'aria e il sensore di pressione dell'aria al PCB con un cavo elettrico.
      NOTA: Dopo che tutte le parti necessarie sono disponibili, l'unità di controllo della pressione dovrebbe essere costruita in circa 2 ore.
2. Collegare la scheda di acquisizione dati secondaria (DAQ).
   1. Collegare le uscite dati dalla scheda a circuito stampato alla scheda DAQ, seguendo la Tabella 1.
      nota: La scheda DAQ funzionerà in "modalità single-ended". La mappa delle porte si trova nel manuale utente (vedere la Tabella dei materiali).
   2. Collegare "AIn Pr S" a uno dei canali di ingresso analogico (AI) e "R-Gr" a una delle masse analogiche sulla scheda DAQ secondaria.
   3. Collegare l'uscita primaria dall'amplificatore a uno dei canali AI e la massa alla massa analogica della scheda DAQ secondaria.
      NOTA: È possibile utilizzare un cavo BNC standard per collegare l'uscita primaria dall'amplificatore.
   4. Spellare l'altra estremità e collegare il segnale positivo (cioè il nucleo di rame) al canale AI e la terra (cioè il filo sottile attorno al nucleo) alla terra analogica. Ripetere questo passaggio per un secondo canale se viene utilizzato più di un canale patch.
      NOTA: L'ingresso analogico della scheda DAQ verrà configurato nei passaggi successivi.
   5. Collegare l'alimentazione all'uscita di alimentazione della scheda DAQ secondaria. Utilizzare una fonte di alimentazione separata da 12 V per la pompa.
3. Collegare il tubo.
   1. Collegare la pompa dell'aria e le due valvole.
   2. Nell'ultimo passaggio, utilizzare un connettore a 3 vie per collegare il tubo morbido dalla porta superiore della valvola 2 al sensore di pressione e al supporto della pipetta.
   3. Se si utilizzano due pipette, aggiungere un altro connettore a 3 vie al tubo collegato al supporto della pipetta. Durante l'applicazione del patch, passare manualmente tra le valvole e le pipette in uso.
4. Installa Autopatcher IG.
   NOTA: Requisiti di sistema: Autopatcher IG è stato testato solo su un PC con Windows 7. Non è stato convalidato per altri sistemi operativi. La procedura descritta si applica specificamente all'hardware elencato nella Tabella dei materiali.
   1. Scarica Autopatcher-IG da GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Installa Python (vedi la Tabella dei materiali per la versione e l'indirizzo di download).
   3. Disinstalla la libreria PyQt4 digitando "pip uninstall PyQt4" in un terminale della riga di comando.
      nota: Il sistema utilizza una versione precedente della libreria PyQt4 per ottenere la compatibilità con le librerie Qwt e Opencv.
   4. Installa le librerie Python dai file storici delle ruote (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Trova i seguenti file: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) e Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Per installare i file wheel, vai alla directory in cui sono salvati i file e digita "pip install ***wheelfilename***.whl". Sostituisci "***wheelfilename***" con il nome effettivo del file.
         NOTA: "cp27" nel nome del file wheel indica Python 2.7 e "win32" indica Windows a 32 bit. Se "win32" non funziona, prova "win64".
   5. Per controllare la telecamera CCD (Charge-Coupled Device), scaricare e installare il programma di installazione per 64 bit (https://www.qimaging.com/support/software/). Quindi scarica MicroManager per 64 bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) per controllare la fotocamera in Python.
   6. Per controllare i manipolatori e il tavolino del microscopio, installare il software di controllo fornito dal produttore.
      nota: In questo modo viene installato anche il driver necessario per controllare i manipolatori. Il pacchetto di installazione viene comunemente fornito in un CD-ROM.
   7. Per controllare la scheda DAQ secondaria, installare la Universal Library da CD-ROM, fornita con l'acquisto della scheda DAQ.
5. Configura l'hardware per Autopatcher IG.
   1. Collegare il tavolino del microscopio e i controller del manipolatore al computer tramite porte USB.
   2. Assegnare i numeri di porta COM all'unità 0: tavolino del microscopio, all'unità 1: manipolatore sinistro e all'unità 2: manipolatore destro, in questo ordine, nel file di configurazione "ports.csv" nella cartella "configuration". Lasciare invaria>ad esempio "SCI" e "1"). nota: Le informazioni sul numero della porta COM possono essere trovate eseguendo il software di configurazione del manipolatore fornito dal produttore. Vai alla scheda "Impostazioni", seleziona "Impostazioni" e la pagina "Movimento" e leggi le etichette per ogni scheda in alto. In alternativa, queste informazioni possono essere trovate in Gestione periferiche PC.
   3. Assegnare i numeri dei canali di ingresso analogico sulla scheda DAQ per un sensore di pressione e i canali patch 1 e 2 (corrispondenti alle unità 1 e 2). Immettere il numero del canale nel file "DAQchannels.csv" nella cartella "configuration".
      nota: Si consiglia di aprire i file .csv con l'applicazione Blocco note anziché con un foglio di calcolo, poiché potrebbe alterare le informazioni durante il salvataggio delle modifiche.
6. Esegui Autopatcher IG.
   1. Accendere l'amplificatore, il controller del microscopio e il controller del manipolatore. Assicurarsi che il software dell'amplificatore sia in esecuzione.
   2. Esegui Autopatcher IG con Python da un terminale a riga di comando come segue: per prima cosa, cambia la directory (comando "cd" per i terminali più comuni) in cui è installato Autopatcher IG, digita "python Autopatcher_IG.pyw" nel terminale a riga di comando e premi il tasto "Invio".
      NOTA: Non eseguire il software di controllo del manipolatore prima di eseguire Autopatcher IG perché occuperà lo stadio del microscopio e il manipolatore, impedendo ad Autopatcher IG di trovare l'hardware. Il software di controllo del manipolatore può essere eseguito dopo che Autopatcher IG è stato completamente avviato se sono presenti moduli aggiuntivi da controllare (ad esempio, il riscaldatore in linea).
7. Tarare la pipetta primaria.
   1. Estrarre le pipette per cerotti. Riempire una pipetta di vetro estratta con una soluzione interna e caricarla sullo stadio principale.
      NOTA: Le pipette di vetro vuote hanno contrasti diversi al microscopio e possono portare a una calibrazione imprecisa.
   2. Spostare la punta della pipetta sul campo visivo del microscopio e metterla a fuoco. Se il tastierino numerico viene utilizzato per spostare i manipolatori e/o il tavolino del microscopio, aggiornare le coordinate premendo "z" sulla tastiera.
      nota: Questa azione non è necessaria se la tastiera (tavolino del microscopio: A/D - asse x, W/S - asse y, R/F - asse z; manipolatori: H/K - asse x, U/J - asse y, O/L - asse z, 1/2 - numero di unità) per controllare il movimento perché le coordinate verranno aggiornate in tempo reale.
   3. Fare clic sul pulsante "Avvia calibrazione" nell'interfaccia grafica utente (GUI) principale per l'unità corrispondente su cui è caricata la pipetta (Figura 2).
      nota: Al termine della calibrazione apparirà una finestra pop-up.
      NOTA: La calibrazione verrà eseguita automaticamente, il che richiederà circa 3,5 minuti. Facendo clic sullo stesso pulsante (ora impostato su "Annulla calibrazione" dopo aver avviato la calibrazione) si interrompe il tentativo di calibrazione.
   4. Salva la calibrazione facendo clic su "salva calibrazione" nella parte inferiore della GUI principale (salva la calibrazione corrente per entrambi i manipolatori e può essere caricata in futuro).
      NOTA: Il campo visivo con ingrandimento basso (4 o 10X) e alto (40X) deve essere allineato affinché la calibrazione secondaria funzioni correttamente. Fare riferimento al manuale utente del sistema ottico in uso per le procedure di allineamento.
       

2. Procedura di Patch Clamp Automatico

1. Preparare fette di cervello acute
2. Preparare le pipette di vetro per il patch clamp.
3. Posiziona una fetta di cervello al centro della camera di registrazione. Stabilizza la fetta con un fermo per fetta o "arpa".
4. Rileva la cella fluorescente.
   1. Trova l'area di interesse sotto l'obiettivo 4X. Sposta il tavolino del microscopio attivando la modalità click-to-move ("CTM") e facendo clic sul centro dell'area di interesse. In alternativa, utilizzare la tastiera per spostare il tavolino del microscopio (A/D - asse x, W/S - asse y, R/F - asse z).
   2. Passa alla lente ad alto ingrandimento e regola la messa a fuoco spostando il microscopio sull'asse z, utilizzando R/F sulla tastiera.
      NOTA: Si consiglia di regolare il livello del bagno d'acqua in modo che il piano focale sotto le lenti a basso e alto ingrandimento sia lo stesso o simile sull'asse z.
   3. Fare clic sul pulsante "Rileva cella" nella colonna principale dell'interfaccia grafica, "Unità 0". Se il LED o la sorgente luminosa laser della configurazione non possono essere controllati dal segnale TTL, accendere manualmente il LED/laser; al termine del rilevamento della cella apparirà una finestra pop-up.
      1. Se necessario, spegnere il LED/laser; un elenco di coordinate delle celle apparirà nell'interfaccia grafica "Posizioni di memoria". Rimuovi le celle indesiderate dall'elenco facendo clic sul pulsante "X" accanto alle coordinate.
      2. In alternativa, se le celle target non sono etichettate in modo fluorescente, fare clic su "Modalità mouse" nella GUI principale. Fare clic sulla cella di interesse; sulla cella apparirà un punto giallo con un numero e le coordinate della cella appariranno nella GUI "Posizioni di memoria".
5. Tarare la pipetta secondaria.
   1. Riempire 1/3 di una pipetta di vetro con la soluzione interna. Caricare la pipetta sul supporto per pipette fissato allo stadio della testa.
   2. Utilizzare la lente a basso ingrandimento. Portare la pipetta nel campo visivo e regolare la messa a fuoco utilizzando la tastiera (H/K - asse x, U/J - asse y, O/L - asse z). Utilizzare "1" e "2" per passare dall'unità 1 all'unità 2 e viceversa.
   3. Caricare la calibrazione primaria facendo clic su "Carica calibrazione". Fare clic sul pulsante "Calibrazione secondaria" nella GUI principale sotto l'unità in uso. Ad esempio, se l'unità 2 è in uso, fare clic sul pulsante "Calibrazione secondaria" nella colonna "Unità 2". Segui le istruzioni della finestra pop-up per passare all'obiettivo ad alto ingrandimento.
6. Applicare una patch a una cella di destinazione.
   1. Assicurarsi che il software "MultiClamp" (cioè amplificatore) sia in esecuzione. Fare clic sul pulsante "Controllo patch" per aprire la GUI "Controllo patch"; l'apertura di questa GUI potrebbe richiedere fino a qualche minuto.
   2. Utilizzare la lente di ingrandimento 40X selezionando "40X" nella colonna principale della GUI "Unità 0". Fare clic sul pulsante "vai a" accanto alla cella di interesse nell'elenco delle coordinate nell'interfaccia utente grafica "Posizione memoria"; Il microscopio si sposterà sulla cellula.
   3. Fare clic sul pulsante CTM dell'unità in uso nell'interfaccia grafica principale per abilitare il movimento dopo un clic del mouse. Fare clic sulla cella di interesse; La punta della pipetta si sposterà verso la cella.
   4. Fare clic sul pulsante "Patch" nella GUI.
      "Controllo patch" nota: Inizierà il patching automatico e la pressione e la resistenza potranno essere monitorate sulla GUI "Patch control".
      1. Utilizzare il pulsante "Unità 1 selezionata" per commutare il segnale di ingresso tra le due unità.
         NOTA: Il sistema si avvicinerà alla cella target, applicherà una pressione negativa, corrisponderà al potenziale della membrana cellulare e rileverà la formazione di gigaseal in base a una serie di soglie e logica di pressione e resistenza.
      2. Manipolare il processo automatico in qualsiasi momento facendo clic sui rispettivi pulsanti nell'interfaccia grafica "Controllo patch". Ad esempio, fare nuovamente clic sul pulsante "Patch" per annullare la versione di prova della patch e fare clic su "Fase successiva" per far avanzare il processo di applicazione delle patch al passaggio successivo, indipendentemente dalla soglia.
         NOTA: Una finestra pop-up avviserà l'utente quando si è formato un gigaseal e verrà presentata l'opzione per applicare lo zap insieme a una grande pressione negativa.
   5. Selezionare "Sì" per eseguire il rodaggio con lo zap e l'aspirazione combinati. In alternativa, selezionare "No" per rodare solo con aspirazione.
      NOTA: Quando una patch a cella intera è completata con successo, una finestra pop-up ricorderà all'utente di salvare il registro delle patch dell'esperimento.
   6. Salva la patch dell'esperimento log.
      NOTA: Se una prova di applicazione delle patch non riesce, una finestra pop-up avviserà l'utente e il processo di patch verrà ripristinato.
   7. Torna al passaggio 2.4 e ripeti i passaggi con una cella diversa.

Risultati

Tabella 1. Configurazione del collegamento da circuito stampato (PCB) a scheda di acquisizione dati secondaria (DAQ). Utilizzare questa tabella per collegare le uscite PCB (prima colonna da sinistra) alle porte sulla scheda DAQ (seconda colonna da sinistra). Il nome e il numero della porta sul DAQ secondario si riferiscono alla modalità single-ended.

...

Uscita sul PCB

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Telecamera CCD	QImaging	Bullone Rolera
Impianto di elettrofisiologia	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscopio e manipolatori. Il software di controllo del manipolatore fornito dal produttore illustrato in questo manoscritto è "Linlab2".
amplificatore	Dispositivi molecolari	MultiClamp 700B	amplificatore per microelettrodi controllato da computer
digitalizzatore	Dispositivi molecolari	Axon Digidata 1550
Fonte luminosa a LED	LED freddo	pE-100	Lunghezza d'onda 488nm
Scheda di acquisizione dati	Calcolo delle misure	USB1208-FS	DAQ. secondario Vedere il manuale all'indirizzo: http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Elettrovalvole	La Lee Co.	LHDA0531115H
pompa pneumatica	Industria virtuale	VMP1625MX-12-90-CH
Sensore di pressione dell'aria	Semiconduttore a scala libera	MPXV7025G
Fissaggio della fetta	Strumenti Warner	64-1415 (SHD-40/2)	Kit di ancoraggio per fette, piatto per camera RC-40, 2,0 mm, 19,7 mm
pitone	anaconda	Versione 2.7 (32 bit per Windows)	https://www.continuum.io/downloads
Terminali a vite (2 pin)	Divertimento scintillante	PRT - 08084	Terminali a vite, passo da 3,5 mm (2 pin)
MOSFET a canale N 60V 30A	Divertimento scintillante	COM - 10213
Prese DIP Coda a saldare - 8 pin	Divertimento scintillante	PRT-07937
LED - Rosso di base 5mm	Divertimento scintillante	COM-09590
LED - Verde di base 5mm	Divertimento scintillante	COM-09592
Jack/connettore di alimentazione cilindrico CC (SMD)	Divertimento scintillante	PRT-12748
Alimentatore adattatore da parete - 12VDC 600mA	Divertimento scintillante	TOL-09442
Cavo di collegamento - Assortimento (nucleo solido, 22 AWG)	Divertimento scintillante	Codice PRT-11367
Rubinetto di bloccaggio maschio x femmina x femmina	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tubi flessibili Tygon S3 E-3603	Fisher scientifico	14-171-129	Diametro esterno: 1/8 di pollice Diametro interno: 1/16 in.
Cavo coassiale BNC maschio a BNC maschio	Componenti Belkin	F3K101-06-E
Resistenza da 560 Ohm (tolleranza del 5%)	Baracca Radiofonica	2711116
Picospritzer	Valvola generale	Picospritzer II