Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione della soluzione di perfusione e dei composti di prova
- Preparare 5 L di soluzione di Krebs: 113 mM di cloruro di sodio, NaCl, 5,9 mM di cloruro di potassio, KCl, 1,2 mM di fosfato di sodio monogeno, NaH2PO4, 1,2 mM di solfato di magnesio, MgSO4, 25 mM di bicarbonato di sodio, NaHCO3, 1,2 mM di cloruro di calcio, CaCl2 e 11,5 mM di glucosio. Saturare la soluzione con una miscela di gas 95% O2 + 5% CO2. Pre-raffreddare ~500 ml di Krebs ossigenato in frigorifero.
- Preparare aliquote di composti madre per il test (1 mM di capsaicina in etanolo e 10 mM di 5-idrossitriptamina (5-HT) in soluzione fisiologica) secondo necessità. Diluire il brodo in Krebs (per l'applicazione in bagno) e in soluzione salina (per la somministrazione intraluminale) fino alla concentrazione finale appena prima dell'uso.
2. Preparazione dell'elettrodo di registrazione
- Estrarre l'elettrodo di registrazione da tubi di vetro standard senza filamenti interni (diametro esterno 1,5 mm) utilizzando un estrattore di elettrodi convenzionale. Regolare le impostazioni dell'estrattore per il calore e tirare in modo che il gambo degli elettrodi estratti sia compreso tra 20 e 25 mm.
3. Raccolta dei tessuti
- Anestetizzare profondamente il ratto utilizzando pentobarbital sodico (80 mg/kg, i.p.).
- Pur garantendo la sterilità, esporre la cavità addominale eseguendo un'incisione sulla linea mediana sulla parete addominale utilizzando un bisturi. Tirare da parte il mesentere e gli altri tessuti per esporre il colon-retto.
- Posizionare l'animale sotto il microscopio da dissezione. Attraverso un'attenta dissezione, localizzare il ganglio pelvico sinistro (PG) e identificare i nervi pelvici (PN) e i nervi splancnici lombari (LSN) che lo uniscono. Tagliare questi nervi a pochi millimetri di distanza dal PG.
nota: Il PG si trova vicino alla giunzione colorettale. Tipicamente, 3 - 4 PN dal midollo spinale lombosacrale e un progetto LSN al PG (Figura 1).
- Tagliare l'osso della sinfisi per esporre il retto. Rimuovere i tessuti (es. vescica urinaria, ecc.) sopra il colon-retto; fare attenzione a lasciare intatto il PG.
- Sacrificare il ratto con l'iniezione endovenosa di un'overdose di pentobarbital. Sezionare il colon a circa 3 cm sopra il PG e rimuovere il colon-retto dall'animale usando una pinza.
- Trasferire il colon-retto in una capsula di Petri riempita con una soluzione di Krebs pre-raffreddata. Rimuovere le feci sciacquando delicatamente il colon. Rimuovere con cura il residuo della vescica urinaria e altri tessuti, senza compromettere il PG.
4. Dissezione dei nervi afferenti del colon
- Posizionare il colon in una camera di registrazione (20 mL) e perfondere continuamente il tessuto con una soluzione di Krebs carbogenata. Impostare la velocità di perfusione a 15 mL/min.
- Incannulare il colon-retto sia all'estremità orale che anale. Iniziare l'infusione intraluminale del colon con soluzione fisiologica a una velocità di 10 mL/h in direzione orale-anale.
- Individuare il PG principale sotto il microscopio da dissezione. Usa spilli per insetti per esporre il ganglione. Con un'attenta dissezione, trovare un sottile ramo del nervo che emana dal ganglio e corre verso il colon (Figura 1). Taglia il nervo vicino al ganglio.
NOTA: La Figura 1 illustra una registrazione da un ramo nervoso distale al PG. Il nervo contiene presumibilmente una miscela di fibre afferenti splancniche pelviche e lombari. In alternativa, è possibile effettuare una registrazione dal PN e/o dall'LSN prossimale al PG.
- Accendere il bagno di riscaldamento e riscaldare la soluzione di Krebs per mantenere la temperatura della camera a 34 ± 0,5 °C.
5. Preparazione dell'elettrodo di aspirazione
- Prendi una pipetta di vetro pre-estratta (fase 2) e ispezionala al microscopio da dissezione. Rompere la punta dell'elettrodo con un paio di pinze in modo che sia di dimensioni compatibili con il diametro del nervo da registrare.
- Smussare la punta posizionandola vicino a una svasatura più chiara.
6. Registrazione elettrofisiologica
- Collegare l'elettrodo smussato al portaelettrodo. Collegare una siringa da 10 ml alla porta laterale del supporto per applicare una pressione negativa o positiva all'elettrodo.
- Collegare il supporto all'headstage del bioamplificatore e montare l'headstage su un manipolatore.
- Spostare l'elettrodo nel bagno di tessuto e riempire l'elettrodo con la soluzione di Krebs applicando un'aspirazione delicata fino a quando non tocca il filo d'argento del supporto. Posizionare la punta dell'elettrodo vicino all'estremità tagliata del nervo e applicare una pressione negativa per aspirare il nervo nell'elettrodo. Applicare più pressione negativa in modo che ~1 mm del nervo venga tirato nell'elettrodo e formi una tenuta ermetica.
- Accendere il bioamplificatore e impostare il filtro su 300 - 3.000 Hz. Monitorare il segnale sull'oscilloscopio e registrare il segnale nervoso (frequenza di campionamento di 20 kHz) e il segnale di pressione intraluminale (frequenza di campionamento di 100 Hz) utilizzando un computer con software di elaborazione dei dati spike.
7. Testare la sensibilità afferente del colon
- Applicare la distensione a rampa del colon chiudendo il rubinetto a tre vie sulla cannula di uscita mentre si infonde continuamente per via intraluminale. Monitorare la pressione intraluminale fino a raggiungere i 60 mmHg, dopodiché aprire il rubinetto a tre vie sulla cannula drenante.
