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1. Semina e tratta cellule endoteliali vascolari cerebrali (CVE) su piastre di coltura cellulare
- Seminare cellule CVE (cellule bEnd.3) su una piastra di coltura cellulare a flusso extracellulare a 96 pozzetti: 80 μL/pozzetto. Posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2. Nota: 16 × 103 celle per pozzetto raggiungeranno il 60-80% di confluenza entro 24 ore.
- Se le cellule sono esposte a una sostanza chimica, aggiungere i trattamenti una volta che le cellule sono attaccate al fondo della piastra (8 - 24 ore dopo la semina).
nota: Per gli esperimenti di trasfezione, non aggiungere antibiotici in un terreno di coltura completo.
2. Valutazione della funzione mitocondriale utilizzando il bioanalizzatore
- Prima dell'inizio del saggio, idratare una cartuccia del sensore di flusso extracellulare con calibrante aggiungendo 150 μl di soluzione calibrante del flusso extracellulare alla piastra e incubando per una notte a 37 °C senza CO2.
- Utilizzando la stazione di lavaggio delle piastre, trasformare il terreno di coltura cellulare in un terreno di saggio del flusso extracellulare a pH 7,0. Incubare le cellule a 37 °C senza CO2 per 30 - 60 minuti.
- Preparare soluzioni di lavoro di 8 μM di oligomicina, 4,5 μM di carbonilcianuro 4-(trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP), 10 μM di rotenone e 10 μM di antimicina A nel Medium di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM). Caricare 25 μL delle soluzioni madre nelle porte di iniezione della cartuccia: porta A, oligomicina; Porta B, FCCP; Porta C, rotenone e antimicina A con terreno di saggio del flusso extracellulare. Implementare il protocollo di analisi come descritto nella Tabella 1.
- Caricare la cartuccia idratata nel bioanalizzatore ed eseguire la calibrazione facendo clic sul pulsante "Start". Al termine della calibrazione, rimuovere la piastra inferiore della cartuccia e caricare la piastra della cella facendo clic sul prompt "Scarica cartuccia". Continuare il test fino al completamento di tutte le misurazioni.
- Aprire il file di dati e ottenere i valori di velocità dal bioanalizzatore. Esporta i dati in un file di foglio di calcolo.
Tabella 1. Il protocollo di funzionamento dello strumento.
