Registrazione dell'attività del nervo afferente mesenterico in un segmento di digiuno di topo ex vivo

Abstract

Fonte: Nullens, S., et al. Registrazione in vitro dell'attività del nervo afferente mesenterico nei segmenti digiunale e del colon di topo. J. Vis. (2016).

Questo video mostra il processo di registrazione dei segnali elettrici dai nervi afferenti mesenterici in un segmento digiunale di topo sezionato per studiare gli effetti della pressione tissutale e dei cambiamenti di movimento sull'attività del nervo afferente.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del nervo afferente digiunale

1. Eseguire l'eutanasia dei roditori dell'adolescente o del roditore adulto che è stata approvata prima dell'esperimento dal Comitato Etico locale (ad esempio, sedazione terminale seguita da puntura cardiaca, lussazione cervicale, ecc.).
   nota: Abbiamo utilizzato la lussazione cervicale per sacrificare gli animali, ottenendo così esperimenti senza la necessità di ulteriore anestesia o cure post-chirurgiche poiché i tessuti vengono ulteriormente lavorati in vitro.
   nota: È stato dimostrato che l'età attenua le funzioni meccanosensoriali afferenti mesenteriche, pertanto consigliamo ai ricercatori di aderire a una specifica fascia di età per la durata di un singolo esperimento.
2. Posizionare l'animale da laboratorio sacrificato in posizione supina ed eseguire un'incisione della linea mediana addominale attraverso la pelle e lo strato muscolare addominale utilizzando un bisturi, estendendosi dal processo xifoideo fino all'osso pubico.
3. Bagnare la cavità addominale con una soluzione fredda di Krebs per evitare che i tessuti intra-addominali si secchino (composizione di Krebs: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH₂PO₄, 15,43 mM NaHCO₃, 1,21 mM MgSO₄, 11,52 mM D-glucosio e 1,52 mM CaCl₂).
4. Asportare rapidamente l'intero digiuno utilizzando forbici affilate asportando circa 20 cm dell'intestino tenue iniziando immediatamente distalmente dalla flessura duodenodigiunale, facendo attenzione a non danneggiare le strutture circostanti e mantenendo intatto il mesentere dell'intestino, che contiene i vasi sanguigni digiunali e i nervi afferenti><. nota: Per la mera dissezione digiunale nella cavità addominale, non è necessario utilizzare uno stereomicroscopio, poiché questo può essere facilmente visualizzato ad occhio nudo.
5. Porre il digiuno asportato in una soluzione ghiacciata di Krebs e tenerlo in ghiaccio ossigenando continuamente la soluzione di Krebs con carbogeno (95% O₂, 5% CO₂).
6. Tagliare il digiuno con forbici affilate in anelli lunghi circa 3 cm. Osservare il fascio mesenterico contenente i vasi e il nervo splancnico da qualche parte vicino al centro del rispettivo anello.
7. Lavare ogni segmento con la soluzione di Krebs utilizzando un catetere smussato per rimuovere il contenuto luminale e il chimo, poiché questi contengono enzimi digestivi che accelerano il deterioramento del campione di tessuto in vitro.
   nota: Fare attenzione a non danneggiare il lume dell'ansa durante il lavaggio, poiché la distruzione dei villi comporterà il rilascio di mediatori che possono alterare l'attività del nervo afferente.
8. Identificare il segmento per misurare l'attività del nervo afferente (ad esempio, il primo segmento digiunale distalmente del legamento di Treitz o la flessura duodenodigiunale) e posizionarlo in una camera di registrazione appositamente costruita rivestita con uno strato di elastomero siliconico><. nota: L'inizio del digiuno è anatomicamente definito come la parte dell'intestino tenue in cui il legamento di Treitz attraversa l'intestino tenue, chiamata anche flessura duodenodigiunale.
   nota: Coprire il fondo della camera di registrazione con un sottile strato di elastomero siliconico ben prima dell'inizio dell'esperimento. Preparare questo strato di elastomero secondo le istruzioni del produttore.
9. Perfondere costantemente la camera con una soluzione calda di Krebs carbogenata alla velocità di 10 ml/min e mantenere costante la temperatura di Krebs nella camera di registrazione a 34 °C.
10. Montare il segmento digiunale nel bagno dell'organo in modo che l'estremità orale sia collegata al driver della siringa che fornisce il flusso luminale e l'estremità aborale si colleghi al deflusso. Allungare leggermente il segmento ma fare attenzione a non esercitare una tensione eccessiva. Fissare saldamente entrambe le estremità utilizzando legature di seta 4/0 alle porte di ingresso e uscita.
11. Collegare il driver della siringa all'estremità orale e perfondere il segmento digiunale per via intraluminale con la soluzione di Krebs (non ossigenata, a temperatura ambiente) a una velocità di 10 ml/ora.
12. Utilizzare spilli per insetti per appuntare il mesentere del segmento intestinale montato contro lo strato inferiore in elastomero siliconico. Allungare il mesentere per ottimizzare la visualizzazione del fascio mesenterico; Non esercitare sforzi sul fascio o sul digiuno.
13. Eseguire una distensione della rampa di prova (vide infra) chiudendo la porta di uscita fino a quando la pressione intraluminale del segmento intestinale raggiunge i 60 mmHg per verificare che non vi siano perdite di soluzione di Krebs intraluminale dal segmento montato. Osservare un aumento graduale della pressione intraluminale senza interruzioni.
14. Osservare piccole contrazioni del segmento (onde peristaltiche) durante la fase iniziale di distensione. Se necessario, bloccare l'attività peristaltica aggiungendo 1 μM di nifedipina bloccante dei canali del calcio di tipo L alla soluzione di Krebs.
    nota: L'aggiunta di 1 μM di atropina alla soluzione di Krebs in aggiunta alla nifedipina paralizzerà completamente il segmento intestinale.
15. Sotto uno stereomicroscopio, inizia delicatamente a staccare il tessuto adiposo dal mesentere tirandolo delicatamente con due piccole pinzette, facendo attenzione a non danneggiare i vasi e il nervo afferente che giacciono sepolti nel tessuto adiposo.
16. Inizia a una distanza remota dal digiuno ed esponi entrambi i vasi sanguigni nel fascio mesenterico.
17. Osserva il nervo digiunale afferente tra i due vasi come un sottile filo bianco incapsulato nel tessuto adiposo. Sezionare più prossimalmente verso il digiuno staccando delicatamente il tessuto adiposo con una pinzetta solo quando l'identificazione iniziale di entrambi i vasi mesenterici e/o del nervo afferente è difficile.
18. Sezionare il nervo mesenterico digiunale del segmento libero su una distanza di diversi millimetri, rimuovendo il tessuto adiposo aderente al nervo.
19. Seziona il nervo usando forbici affilate per tessuti. Se necessario, staccare il grasso e il tessuto connettivo rimanenti, nonché la guaina epineuronale, tirandola delicatamente con le piccole pinzette.
20. Utilizzando un micromanipolatore, abbassare la punta dell'elettrodo di aspirazione, collegata a una siringa con uno stantuffo, nel bagno dell'organo; quindi, manipolando lo stantuffo, aspirare delicatamente un po' di soluzione di Krebs dal bagno dell'organo in modo che la punta dell'elettrodo sia immersa nella soluzione di Krebs (Figura 1). Assicurarsi che la soluzione di Krebs copra l'elettrodo a filo all'interno dell'elettrodo di aspirazione.
    nota: Utilizzare un estrattore per pipette per preparare il capillare di aspirazione in vetro borosilicato contenente l'elettrodo a filo prima dell'inizio dell'esperimento.
21. Posizionare la punta dell'elettrodo di aspirazione immediatamente accanto al filamento nervoso afferente sezionato e aspirare il filamento nervoso sezionato nel capillare per tutta la sua lunghezza.
22. Manovrare la punta dell'elettrodo verso del tessuto adiposo e aspirarlo nel capillare di vetro aspirando saldamente con lo stantuffo, "sigillando" così meccanicamente il nervo nel capillare dal contenuto del bagno d'organo.
23. Verificare la registrazione dell'attività del nervo afferente utilizzando il sistema di acquisizione dati, ad esempio eseguendo un aumento dell'attivazione afferente indotto dalla distensione a rampa (vide infra). Dopo l'isolamento del nervo nell'elettrodo di aspirazione, stabilizzare la preparazione per 15 minuti al fine di ottenere uno stato costante di attività nervosa afferente spontanea prima di eseguire gli esperimenti veri e propri.
24. Per eseguire la distensione a rampa, distendere il segmento intestinale chiudendo la porta di uscita, portando ad un graduale aumento della pressione (fino a 60 mmHg). Eseguire il protocollo sperimentale desiderato solo quando tre distensioni consecutive della rampa (con un intervallo di 15 minuti) producono una scarica multi-unità riproducibile (Figura 2).

Risultati

Figura 1: Panoramica schematica della camera di registrazione e dell'elettrodo di aspirazione appositamente costruiti. Panoramica dettagliata della configurazione tecnica con l'elettrodo di aspirazione e la camera di registrazione in posizione.

Figura 2: Tracci...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro di sodio (NaCl)	Prodotti chimici VWR	2,78,10,295	soluzione di Krebs composta
Cloruro di potassio (KCl)	Acros organics	196770010	soluzione di Krebs composta
Diidrogeno fosfato di sodio (NaH2PO4)	Prodotti chimici VWR	1,06,34,61,000	soluzione di Krebs composta
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)	Merck	1,06,32,91,000	soluzione di Krebs composta
Solfato di magnesio (MgSO4)	Merck	1,05,88,61,000	soluzione di Krebs composta
Cloruro di calcio (CaCl2)	Merck	2,38,11,000	soluzione di Krebs composta
D-glucosio	Prodotti chimici VWR	Codice 1011175P	soluzione di Krebs composta
acqua distillata			soluzione di Krebs composta
Tubi in PVC	Forniture per laboratori scientifici		Il segmento intestinale deve essere montato su un tubo in PVC
Tubi in silicone	Forniture per laboratori scientifici		Il resto del tubo, idealmente a base di silicone, rimuove più facilmente i detriti nel tubo
Filo di seta	Pearsall limitata	Codice 10B15S220	Fissaggio del segmento sul tubo in PVC
Driver per siringhe	Apparato di Harvard	55-2222	Infusione intraluminale di Krebs
Binocolo - incluso ingrandimento 10x in oculair	Zeiss STEMI 2000		Visualizzazione ottimale per la dissezione del nervo afferente
Unità di controllo per coperte omeotermiche	Apparato di Harvard	507214	Riscaldamento della camera dell'organo
Vasca d'organo su misura con fondo rivestito in Sylgard
Software Spike2			Registrazione e analisi dei dati
Spine per insetti, 500 pezzi, acciaio inox, diametro 0,2 mm	Austerlitz insetti spilli minuzie		Dissezione del nervo afferente
Pinzetta Dumont #5 inox 11cm	Strumento di precisione mondiale	500341	Dissezione del nervo afferente
Forbici, molla, 14 cm	Strumento di precisione mondiale	Codice: 15905	Dissezione del nervo afferente
DB digitimer	NL 108T2/10		trasduttore di pressione
Micromanipolatore	Narishige	M-3333	Manipolazione 3D dell'elettrodo di aspirazione
Micromanipolatore	Blocco rotante X-4		Manipolazione 3D dell'elettrodo di aspirazione
Micromanipolatore	Supporto magnetico GJ-8		Manipolazione 3D dell'elettrodo di aspirazione
Sorgente luminosa	Euromex Microscopi Olanda EK-1		Visualizzazione ottimale per la dissezione del nervo afferente
CED 1401 Apparecchio di registrazione			Registrazione dell'attività nervosa afferente
Humbug 50/60Hz Eliminatore di rumore	Strumenti scientifici Quest		Eliminazione del rumore di fondo
Pompa di infusione	Gibson Minipuls 2		Infusione della camera dell'organo in cui è montato il segmento
Supporto per microelettrodo Semicelle 1,5 mm	Strumento di precisione mondiale	MEH2SW	Elettrodo di aspirazione per l'isolamento della fibra afferente
Capillari in vetro borosilicato, 300 pz; 1,5/0,84 OD/ID	Strumento di precisione mondiale	1B150-4	Capillare per l'isolamento del nervo afferente