Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione della Soluzione Sperimentale e dell'Attrezzatura per la Registrazione MEA (Multielectrode Array)
- Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF; 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 1 mM NaH2PO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3 e 10 mM di glucosio, bollato con il 95% di O2 e il 5% di CO2).
- Utilizzare due tipi di sonde MEA: 6 x 10 MEA planari e 8 x 8 MEA. La prima sonda copre la regione che comprende la corteccia, lo striato e il talamo. Quest'ultima sonda copre solo la regione corticale.
- Utilizzare un amplificatore a 60 canali con un filtro passa-banda impostato tra 0,1 Hz e 3 kHz a 1.200 di amplificazione. Acquisisci dati a una frequenza di campionamento di 10 kHz.
- Posizionare due fili d'argento rivestiti di AgCl all'interno della camera MEA per la DCS (stimolazione a corrente continua). Quindi, utilizzare i fili d'argento rivestiti di AgCl per produrre campi elettrici generati da uno stimolatore isolato.
- Posizionare un elettrodo di tungsteno (diametro, 127 μm; lunghezza, 7,62 cm; punta conica 8° AC; resistenza, 5 MΩ) per la stimolazione talamica e posizionare l'elettrodo di riferimento nella camera MEA. Erogare le correnti dell'elettrodo di tungsteno utilizzando uno stimolatore isolato controllato da un generatore di impulsi (Figura 1).
2. Preparazione della Brain Slice
- Utilizzare topi maschi C57BL/6J, di 4-8 settimane. Alloggiare gli animali in una stanza climatizzata (21-23 °C; 50% di umidità; 12 ore/12 ore ciclo luce/buio, luci accese alle 8:00) con libero accesso a cibo e acqua.
- Prelevare un'aliquota di 250 ml di aCSF preparata al punto 1.1 e metterla in un becher pieno di ghiaccio. Allo stesso tempo, fornire gas continuo composto da 95% O2 e 5% CO2.
- chirurgia
- Anestetizzare l'animale con isoflurano al 4% in una scatola di vetro per circa 3 minuti. Una volta che l'animale raggiunge una profondità chirurgica di anestesia (indicata dalla mancanza di una risposta al pizzicamento delle dita), posizionarlo su un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio tritato e rimuovere la testa usando le forbici.
- Esponi il cranio e taglia il muscolo rimanente. Quindi, usando i rongeur, staccare la superficie dorsale del cranio dal cervello. Taglia via i lati del cranio usando i rongeur. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con una soluzione di etanolo al 75%.
- Usando una spatola, tagliare i bulbi olfattivi e le connessioni nervose lungo la superficie ventrale del cervello e rimuovere il cervello. Dopo la decapitazione, e trasferire rapidamente il cervello in un becher riempito con aCSF ossigenato ghiacciato.
- Preparazione del Talamo Mediale (MT)-ACC (corteccia cingolata anteriore) Brain Slice
nota: Preparare le sezioni che contengono il percorso dalla MT all'ACC
- Tagliare a mano il blocco cerebrale con due tagli sagittali di 2,0 mm lateralmente alla linea mediana in ciascun emisfero per visualizzare l'anatomia sottocorticale. Quindi, fai due tagli angolati. Eseguire il primo taglio trasversale parallelo al tratto di fibra visibile nello striato.
- Effettuare il secondo taglio trasversale dalla connessione tra il cervelletto e la corteccia visiva al punto medio tra la commessura anteriore e il tratto ottico che sono ventrali e paralleli alla via del talamocingulato.
- Fissare il blocco cerebrale a una piastra angolare (~120°) con adesivo cianoacrilato e praticare un taglio appena sopra il punto di svolta del percorso. Aprire la piastra, appiattirla e incollarla sul tavolino da camera di un vibratomo.
- Preparare delle fette di cervello mediale di talamo-ACC (500 μm di spessore) e poi immergerle in aCSF ossigenato ghiacciato.Trasferire le fette nella camera di registrazione e mantenerle a 32 °C in perfusione continua (12 ml/min) con aCSF ossigenato per 1 ora.
3. Preparazione della camera di perfusione per la registrazione di array multielettrodo
- Preparazione della camera di perfusione
- Posizionare una sonda MEA su un sistema multicanale e utilizzare due tubi in polietilene separati per collegare la sonda a una pompa peristaltica. Utilizzare un tubo per guidare l'aCSF nella camera MEA e l'altro tubo per guidare l'aCSF fuori dalla camera. Infine, perfondere continuamente il preparato con aCSF ossigenato caldo (29-30 °C) (8 ml/min).
- Trasferisci la fetta di cervello in MEA. Tieni premuta la fetta di cervello sul MEA usando un batuffolo di cotone bagnato. Muovi con cautela la fetta del cervello per assicurarti che l'ACC sia orientato sopra gli elettrodi.
- Usa i kit di ancoraggio e i fermi per premere la fetta del cervello. Questo passaggio garantisce un buon collegamento elettrico tra la fetta e gli elettrodi.
4. Generazione di Campi Elettrici tramite DCS
Nota: La definizione dell'orientamento del campo elettrico si basava sulla direzione dell'asse assodendritico nell'ACC. L'orientamento dei compartimenti dendritico e soma è stato confermato utilizzando la colorazione di Golgi12.
- Posizionare l'elettrodo AgCl (definito come anodo) prossimalmente all'ACC e posizionare l'altro elettrodo (definito come catodo) distalmente all'ACC. Registrare l'intensità di campo generata dai due orientamenti di campo (parallelo e perpendicolare alle fibre assodendritiche dell'ACC) dal MEA ed erogare le correnti dei campi elettrici utilizzando uno stimolatore.
- Fissare la distanza degli elettrodi AgCl (circa 1,5-2 cm) e regolare l'intensità di corrente dello stimolatore per rendere il DCS compreso tra 0,5 e 2 mA.
5. Risposte sinaptiche corticali indotte elettricamente
Nota: Induce risposte sinaptiche nell'ACC mediante stimolazione elettrica nel MT, in cui un generatore di stimolo elettrico programmabile produce impulsi di corrente bifasici rettangolari.
- Ripetere la Sezione 3 sopra.
- Posizionare un elettrodo di tungsteno nella MT ed erogare impulsi dallo stimolatore alla regione talamica delle fette tramite elettrodi di tungsteno bipolari.
- Utilizzare varie intensità di corrente per determinare la soglia che suscita una risposta ACC. In questo caso, utilizzare un'intensità di ±150 μA e una durata di 200 μsec, che ha suscitato una risposta massima dell'80% nell'ACC nella maggior parte delle fette.
- Spostare l'elettrodo di tungsteno lungo la via del talamocingolato (dalla MT al corpo calloso) nella fetta MT-ACC per ottenere i profili di risposta ottimali.
- Effettua 10-20 scansioni di risposte ACC e utilizza il software per calcolare automaticamente la media di tutti gli ACC evocati dalla stimolazione MT. Il risultato sono le risposte sinaptiche nell'ACC indotte dalla stimolazione MT da parte della via MT-ACC.
6. Attività simile a un attacco indotta elettricamente
Nota: l'attività simile alle crisi epilettiche è stata indotta dall'applicazione di 4-aminopiridina (4-AP; 250 μM) e bicucullina (5 μM). Precedenti studi di controllo temporale hanno dimostrato che le risposte massime e stabili apparivano 2-3 ore dopo l'applicazione del farmaco14.
- Ripeti la sezione 5 sopra.
- Aggiungere farmaci alla soluzione di perfusione. Utilizzare 4-AP (4-amminopiridina) (250 μM) e bicucullina (5 μM). Mescolare i farmaci in modo uniforme e continuare la perfusione per 2-3 ore.
- Per facilitare l'attività simile alle convulsioni, mantenere la pompa di perfusione a una velocità di perfusione relativamente veloce (8 ml/min), che può anche aiutare a prevenire l'accumulo di un gradiente di pH.
- Posizionare un elettrodo di tungsteno nella MT ed erogare la stimolazione elettrica (150 μA, durata 200 μsec) per ottenere profili di risposta ACC.
- Fai 10-20 passaggi e fai la media delle risposte.
- Sostituire la soluzione di perfusione con aCSF fresco per lavare via i farmaci. Ripetere il passaggio 6.5.
