Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Farmaci per la microionoforesi
NOTA: I farmaci utilizzati per la microionoforesi devono avere una carica elettrica quando disciolti in acqua. Controllare la letteratura per vedere se il farmaco di interesse è appropriato per questa procedura. Qui viene descritta la procedura per la gabazina, un antagonista del recettore GABAA.
- Filtrare l'acqua distillata utilizzando un filtro a siringa da 0,2 μm per sterilizzarla e assicurarsi che non contenga soluti. Utilizzando quest'acqua distillata, preparare ~1.000 μl di gabazina 20 mM.
- Regolare il pH della diluizione a 4 con NaOH filtrato da 0,2 μm utilizzando un elettrodo pH a punta fine.
- Conservare 100 - 200 μl di aliquote a -20 ºC. Scongelare il giorno della registrazione. Quel giorno, prima che l'animale venga immobilizzato, riempire i cilindri (3 - 5 μl) dell'elettrodo multibarrel con i farmaci, utilizzando una microsiringa da 100 μl dotata di un ago di plastica flessibile.
2. Chirurgia e impianto di testata
- Eseguire esperimenti su due topi maschi CBA/J (Mus musculus) con pesi di 27 e 30 g.
- Nei giorni precedenti l'intervento, maneggiare gli animali e lasciarli esplorare liberamente nella camera di registrazione per abituarli ad essa. Esegui tre sessioni al giorno, ciascuna della durata di almeno 30 minuti. Questo li calmerà e li metterà a proprio agio durante le registrazioni.
- Anestetizzare il topo utilizzando una miscela di ketamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) iniettata per via intramuscolare. Questa dose anestetizza profondamente l'animale per circa 1 ora. Somministrare dosi supplementari pari a un terzo della dose iniziale, se necessario.
- Posizionare l'animale su una coperta riscaldante impostata per mantenere una temperatura di 38 ± 1 ºC e stabilizzare la testa dell'animale in un telaio stereotassico utilizzando due barre auricolari e una barra per il morso. Fare attenzione a non perforare la membrana timpanica con le barre auricolari.
- Proteggi gli occhi applicando una goccia di gel oftalmico.
- Radere il cuoio capelluto con le forbici e applicare lo iodio povidone per disinfettare la pelle.
- Usando un bisturi, praticare un'incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritrarre il periostio che copre il parietale e la parte più rostrale delle ossa occipitali.
- Incollare un palo di duralluminio leggero (peso ~0,65 g, lunghezza 30 mm, Figura 1A) con una base rotonda e piatta (5 mm di diametro) sul cranio. Incolla un filo d'argento al centro del palo della testata, lasciandone libere le estremità. Il filo d'argento verrà utilizzato come elettrodo di riferimento per la registrazione elettrofisiologica.
- Applicare un sottile strato di adesivo fotopolimerizzabile sul cranio e sulla base del palo della testa. Attendi 10 secondi e posiziona il palo sopra l'area rostrale delle ossa parietali, lungo la linea mediana.
- Fotopolimerizzare l'adesivo utilizzando una sorgente di luce blu per 20 secondi per un'efficace forza di adesione.
- Praticare tre fori attorno e dietro la base del palo di testa utilizzando un trapano elettrico e una piccola punta da trapano.
- Posizionare due viti dell'orologio (~2 mm di lunghezza) nei fori praticati per fungere da punti di contatto aggiuntivi tra il teschio e l'headstage. Le viti richiedono 11/2 giri per ottenere una perfetta aderenza. Testare le viti con una pinza per assicurarsi che non siano allentate.
- Inserire la punta del filo di terra in argento nel terzo foro, assicurandosi che tocchi la dura. Applicare una piccola goccia di colla cianoacrilica resistente all'acqua per legare il filo al cranio.
- Applicare il composito fotopolimerizzabile per rafforzare il legame del palo con il cranio. Coprire la base del paletto, la parte bassa del filo d'argento e le viti, facendo attenzione a non estendersi dietro lambda per consentire l'accesso durante la registrazione. Polimerizzare utilizzando una fonte di luce blu.
- Ritrarre il muscolo nella parte posteriore del collo vicino al suo inserimento sul cranio. Utilizzando una piccola trefina (2,35 mm di diametro), praticare una finestra rotonda appena sotto la sutura lambda e lateralmente alla linea mediana, per esporre il collicolo inferiore (IC). Tirare su l'osso di copertura con una pinzetta sottile quando i bordi sono allentati. In caso di sanguinamento, sciacquare con soluzione fisiologica sterile fredda per fermarlo.
- Usa il composito per creare una piccola parete (~1 mm di larghezza e ~1 mm di altezza) attorno alla finestra e fotopolimerizzala.
- Copri il cranio e il muscolo esposti con un unguento antibiotico. Quindi, bagnare la superficie esposta dell'IC con soluzione fisiologica sterile e coprirla con vaselina, riempiendo il pozzetto generato dopo aver realizzato la parete intorno alla finestra di registrazione.
- Iniettare buprenorfina per via sottocutanea (0,03 mg/kg, diluita 1:10 in soluzione fisiologica sterile) come analgesico.
- Tenere l'animale sulla coperta riscaldante fino al risveglio e rimetterlo nella sua gabbia di alloggiamento per riprendersi dall'intervento chirurgico per tre giorni prima delle sessioni di registrazione. Ospita gli animali in una gabbia per ratti per evitare che i compagni di gabbia puliscano la gelatina e il palo della testa tocchi il coperchio della griglia metallica. Metti un po' di arricchimento nella gabbia quando l'animale è alloggiato da solo. Inoltre, cambia la segatura ogni giorno per prevenire l'infezione e controlla attentamente che l'animale si riprenda correttamente e non mostri segni di disagio. Inoltre, controlla se la vaselina è sopra la finestra di registrazione che protegge il cervello esposto.
3. Registrazione elettrofisiologica e microionoforesi
- Dopo il recupero, dare all'animale il tempo di acclimatarsi all'ambiente di registrazione e di tenere la testa trattenuta. Acclimata l'animale fissando il palo al supporto mentre il topo si siede su un sistema di ritenuta in schiuma imbottito su misura intagliato in base alle sue dimensioni corporee (Figura 1B). Ciò limiterà i movimenti del mouse e contribuirà alla sua calma.
- Inizia con sessioni di 10 minuti e aumenta progressivamente la durata fino a 120 minuti. Durante la sessione, premiare gli animali con liquidi dolci (latte condensato, diluito 30:70 in acqua) a intervalli prestabiliti. Successivamente, durante la sessione di registrazione, dare la stessa ricompensa all'inizio e alla fine della sessione o mentre nessun neurone è isolato.
- Se l'animale è eccitato prima della registrazione, iniettare il blando sedativo acepromazina (2 mg/kg, intraperitoneale). Secondo il sistema neurale di interesse, il sedativo può influenzare i risultati.
- Lascia che l'animale esplori liberamente la camera di registrazione per 5 - 10 minuti.
- Posizionare il corpo dell'animale nel sistema di ritenuta imbottito in schiuma su misura (Figura 1B).
- Fissare il palo della testa a un supporto fissato al telaio stereotassico (Figura 1C). Questo è un buon momento per dare all'animale una ricompensa liquida.
- Copri il corpo dell'animale con una coperta di cotone e fissalo senza stringere usando un emicilindro di plastica e del nastro adesivo.
- Rimuovere la vaselina dalla finestra di registrazione e risciacquare con soluzione fisiologica sterile calda.
- Registrare l'attività neurale e l'applicazione ionoforetica della gabazina.
- Posizionare l'elettrodo multibarile sul suo supporto, controllato da un microdrive e collegato a un micromanipolatore.
- Collegare i cavi per la registrazione utilizzando piccole clip a coccodrillo. Collegare il terminale positivo all'estremità dell'elettrodo di tungsteno e il terminale di terra al filo d'argento che entra in contatto con la dura.
- Posizionare un filo d'argento non rivestito all'interno di ogni canna in modo che un'estremità entri in contatto con la soluzione e l'altra sia accessibile. Collegare tali estremità al dispositivo di microionoforesi, seguendo le istruzioni del produttore.
- Muovi l'elettrodo multibarrel finché la punta non tocca la superficie del cervello. Applicare soluzione fisiologica sterile calda per prevenire l'essiccazione del tessuto cerebrale. A quel punto, applicare una corrente di ritenzione (-10 nA per la gabazina; controllare la letteratura per il particolare farmaco) per evitare la fuoriuscita del farmaco dalla punta del cilindro durante la ricerca dell'attività di una singola unità.
- Utilizzare tecniche standard per isolare l'attività extracellulare di un singolo neurone. Ottenere l'area di risposta in frequenza (FRA) del neurone, cioè la combinazione di frequenze e intensità in grado di evocare una risposta perché il neurone è sensibile a questi suoni.
- Scegli due frequenze (f1 e f2) che evochino una velocità e un modello di sparo simili. Presentare ciascuna di queste frequenze come stimolo raro e ripetitivo sotto il paradigma stravagante.
nota: In breve, nel paradigma oddball, una frequenza (f1) è presentata come lo stimolo ripetitivo con un'alta probabilità di occorrenza, mentre la seconda (f2) è lo stimolo deviante che si verifica raramente, intervallato casualmente tra quelli ripetitivi. In una seconda sequenza oddball, le probabilità relative dei due stimoli sono invertite.
- Rilasciare la gabazina spostando la corrente su valori positivi (10 - 20 nA). Ottenere di nuovo il FRA e ripetere il paradigma stravagante sotto l'applicazione gabazina. Mantenere l'espulsione fino a quando non si osserva un effetto visibile nella velocità di sparo; Di solito ci vogliono 5-20 minuti, a seconda del farmaco in questione, della sua concentrazione e dell'entità della corrente di eiezione. Ripetere il protocollo di registrazione per ottenere i valori sotto l'effetto del farmaco.
- Arrestare l'iniezione riportando la corrente ai valori di ritenzione. Attendere che l'effetto del farmaco svanisca monitorando se il FRA o la risposta al paradigma stravagante ritornano ai valori di controllo.
nota: Le sessioni di registrazione possono durare 2 - 3 ore al giorno e devono essere terminate prima se l'animale mostra segni di disagio o difficoltà. Dai una ricompensa liquida e copri la camera di registrazione con vaselina.
