Registrazione dell'attività elettrofisiologica della rete neuronale in una co-coltura neurone-astrocitaria

Abstract

Fonte: Taga, A., et al. Istituzione di una piattaforma elettrofisiologica per la modellazione della SLA con astrociti e neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane specifiche a livello regionale. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra la creazione di una co-coltura neurone-astrocita per la registrazione dell'attività della rete neuronale. Dopo aver stabilito la co-coltura di motoneuroni e astrociti su una piastra multi-electrode array (MEA), l'attività elettrica ritmica sincrona della rete neuronale è stata registrata extracellulare utilizzando il MEA.

Protocollo

1. Co-coltura di MN e astrociti del midollo spinale in piastre di array multi-elettrodo

1. Differenziare e placcare i motoneuroni e gli astrociti quando sono pronti per essere utilizzati lo stesso giorno e invecchiati in vitro (DIV) 60 per i motoneuroni e DIV 90 per gli astrociti.
2. Rivestire le piastre MEA il giorno prima o il giorno della placcatura come segue se si lavora con piastre di plastica a 24 pozzetti (Tabella dei materiali).
3. Diluire la poliornitina (PLO) in acqua o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 100 μg/mL.
   1. Aggiungere 15-20 μl a ciascun pozzetto (a seconda del livello di comfort della pipetta), formando una gocciolina al centro del pozzetto che copra l'area degli elettrodi e l'area circostante, ma non l'intero pozzetto.
   2. Fare attenzione a non danneggiare gli elettrodi con la punta della pipetta. Essere coerenti con il volume da pozzetto a pozzetto per garantire la copertura della stessa superficie in ciascun pozzetto.
   3. Incubare l'OLP a 37 °C per un minimo di 1 ora (preferibilmente 2 ore).
      nota: I piccoli volumi si asciugheranno se non c'è abbastanza umidità nelle piastre. Aggiungere acqua agli scomparti che circondano i pozzetti per garantire un'umidità sufficiente durante il corso del rivestimento e delle registrazioni.
4. Aspirare quanto più PLO possibile utilizzando un puntale per micropipette in plastica. Fare attenzione a non toccare gli elettrodi. Lavare con 250 μL di acqua tre volte. Se si utilizza un aspiratore a vuoto per i lavaggi, non avvicinare la punta all'array di elettrodi. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere quanta più acqua possibile, utilizzando una punta per pipetta se necessario. Lasciare asciugare la superficie sotto la cappa di coltura cellulare con il coperchio rimosso.
5. Una volta che le superfici delle piastre sono asciutte, aggiungere la laminina diluita a 10 μg/mL in PBS. Utilizzare 15-20 μl per coprire ogni array di elettrodi. Aggiungere acqua negli scomparti per l'umidità, riposizionare il coperchio e riportare la piastra a 37 °C in incubazione per un minimo di 2 ore fino a tutta la notte.
6. Il giorno della piastratura, sciacquare una volta le colture di motoneuroni (MN) e astrociti con PBS e aggiungere tripsina 0,05% a 37 °C per sollevare le cellule (5 min). Raccogliere in una provetta conica da 15 ml contenente l'inibitore della tripsina e lavare le piastre con terreno o base per assicurarsi che tutte le cellule siano raccolte. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti e risospendere con una pipetta da 1000 μL per generare 1 mL di una sospensione di una singola cellula. Quando si ri-sospendono MN e astrociti, passare al terreno di co-coltura (Tabella 1), con l'aggiunta di 20 μM di proteina a spirale associata a Rho-M che forma l'inibitore della serina/treonina chinasi (ROCK-I).
7. Contare il MN e gli astrociti in parallelo utilizzando un emocitometro. Durante il conteggio e l'esecuzione dei calcoli, tappare le sospensioni cellulari e posizionarle in una rastrelliera di polistirolo a 4 °C.
8. Calcolare il volume necessario per risospendere le colture a una concentrazione di 5 x 10⁴ cellule per 5 μl per i motoneuroni e 2,5 x 10⁴ cellule per 5 μl per gli astrociti. Centrifugare le sospensioni cellulari da 1 mL a 300 x g per 5 minuti e risospendere nel volume calcolato.
9. Calcolare il numero di pozzetti desiderati da seminare e moltiplicarlo per 5 μL di ciascuna sospensione cellulare. Combinare il volume richiesto di sospensioni di neuroni e astrociti in un rapporto 1:1 e mescolare pipettando fino a quando non è completamente combinato (di solito due volte), evitando di essere troppo aggressivi.
10. Rimuovere la laminina da ciascun pozzetto della piastra MEA utilizzando una punta per pipetta. Trasferire 10 μl della sospensione cellulare combinata finale in ciascun pozzetto, formando una piccola gocciolina che copre l'array di elettrodi per fornire una densità cellulare di 5 x 10⁴ MN e 2,5 x 10⁴ astrociti per pozzetto.
    nota: L'elevata densità cellulare nella sospensione combinata richiede una frequente risospensione tra i pozzetti durante la fase di semina per garantire una conta cellulare accurata e costante.
11. Rimettere le piastre nell'incubatrice per 20-30 minuti. Fare attenzione a non disturbare la gocciolina cellulare e lasciare che le cellule formino attacchi iniziali sulle piastre.
12. Dopo 20-30 minuti, aggiungere un terreno di co-coltura caldo + ROCK-I a ciascun pozzetto pipettando 250 μl sulla parete di ciascun pozzetto, seguiti da altri 250 μl lungo la parete dello stesso pozzetto sul lato opposto. Rimettere la piastra nell'incubatrice.
13. Esaminare le piastre il giorno dopo la semina (Co-coltura Giorno 1). In caso di presenza di detriti cellulari o cellule morte significativi, sostituire il terreno con un terreno di co-coltura fresco contenente ROCK-I. In caso contrario, cambiare il terreno il secondo giorno dopo la semina (giorno 2 di co-coltura) con il terreno di co-coltura senza ROCK-I. Eseguire scambi semi-medi (aspirare il 50% e aggiungere il 60% del volume finale per tenere conto dell'evaporazione) due volte alla settimana.
14. Se si utilizzano sistemi MEA con lastre di vetro da 30 mm a pozzetto singolo (Tabella dei materiali), la preparazione della piastra può richiedere 2 o più giorni. Segui i passaggi seguenti per eseguire questa operazione.
15. Sollevare le cellule e i detriti cellulari dalle precedenti colture MEA con tripsina allo 0,05% per 5-15 minuti.
16. Aspirare la tripsina e risciacquare tre volte con acqua.
17. Sterilizzare aggiungendo etanolo al 70% e incubare nella cappa per 10 minuti. Aspirare l'etanolo, quindi risciacquare con acqua tre volte.
18. Applicare in acqua un detergente anionico all'1% con enzima proteasi. Coprite i piatti con un coperchio e avvolgeteli con pellicola termoplastica e un foglio di alluminio, quindi lasciateli su un bilanciere a temperatura ambiente per una notte.
19. Aspirare il detersivo, quindi risciacquare tre volte con acqua.
20. Se si prevede di conservare i piatti, aggiungere un volume d'acqua sufficiente. Coprite i piatti con un coperchio e avvolgeteli con pellicola termoplastica e foglio di alluminio e lasciateli in frigorifero fino al prossimo utilizzo.
21. Se si prevede di rivestire, lasciare asciugare la superficie sotto la cappa per colture cellulari.
22. Se è necessaria una sterilizzazione extra (ad es. infezione precedente o uso non recente), solo a questo punto, esporre le piastre MEA alla luce ultravioletta (UV) sotto il cofano per 30-60 min.
    nota: Evitare i frequenti raggi UV eviterà danni agli elettrodi. L'uso della luce UV quando le piastre hanno del siero su di esse si tradurrà in elettrodi non funzionanti, motivo per cui dovrebbe essere utilizzato solo su piastre pulite.
23. Quando le piastre sono completamente asciutte, procedere con la pulizia al plasma per 1 minuto per caricare la superficie di vetro delle lastre MEA e migliorare l'efficacia del rivestimento. Pulire al plasma almeno una volta ogni 4-5 cicli di cicli di pulizia-placcatura delle piastre MEA.
    1. In alternativa, quando la pulizia al plasma non è fattibile o non è giustificata, aggiungere un volume sufficiente di terreno contenente siero fetale bovino (FBS) per coprire la superficie delle piastre MEA e rimetterle nell'incubatrice durante la notte.
24. Utilizzare il rivestimento PLO (poliornitina)/laminina. Aggiungere la soluzione di PLO (100 μg in PBS) subito dopo la pulizia o l'aspirazione al plasma e risciacquare il terreno contenente FBS.
25. Piastra le cellule come sopra alle seguenti densità: 1 x 10⁵ astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) / piastra e 5 x 10⁵ motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-MN)/piastra.

2. Registrazione di array multi-elettrodo

1. Estrai i dati grezzi della tensione a una frequenza di campionamento di 12,5 kHz, utilizzando un filtro Butterworth con un filtro passa-alto a 200 Hz e un filtro passa-basso a 3 kHz. Imposta il riconoscimento dei picchi come punti temporali istantanei di tensioni ≥6 deviazioni standard dalla linea di base. Identifica i burst come attività con >5 picchi in 100 ms. Definisci l'attività di rete quando oltre il 35% del totale degli elettrodi attivi si accende entro 100 ms con un minimo di 50 picchi per burst di rete.
2. Iniziare a registrare il prima possibile dopo il giorno 1.
   nota: L'attività elettrica sarà raramente notata prima del CC Day 3.
3. Piastre parallele di colture a densità simili e repliche nelle piastre di coltura o nei vetrini coprioggetti appropriati per saggi biochimici, immunocitochimica (ICC) o PCR quantitativa (qPCR).
4. Eseguire registrazioni con la temperatura impostata su 37 °C e CO₂ al 5%. Trasferire le piastre nella macchina e lasciarle equilibrare per almeno 5 minuti prima della registrazione.
5. Registrare l'attività di base a giorni alterni o settimanalmente, per un periodo compreso tra 1 e 15 minuti a seconda del disegno sperimentale. Non registrare per almeno 1 ora dopo uno scambio medio e idealmente attendere 24 ore dopo ogni scambio di supporti.
6. Per evitare la contaminazione, cambiare il mezzo (cioè mezzo di scambio come al punto 1.14) dopo qualsiasi registrazione in cui il coperchio della piastra sterile deve essere aperto al di fuori della cappa sterile (ad esempio, l'applicazione di composti farmacologici). Eseguire scambi e lavaggi completi del terreno per lavare via i farmaci se le piastre continueranno a essere utilizzate oltre il trattamento farmacologico.
7. Ai fini dell'analisi, utilizzare almeno tre repliche tecniche e biologiche per ciascuna condizione. Esprimere i dati elettrofisiologici come mezzo di n ≥ 3 repliche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di coltura sterili da 10 cm	Falcone	353003
25 cm2 fiasche di coltura sterili	Falcone	353136
Sistema di filtraggio CA da 500 mL 0,2 μm	Corning	430769
Pipetta da 5 ml	Falcone	357543
Piastre di coltura sterili a 6 pozzetti	Falcone	Telefono 3046
Piastre Axion CytoView MEA 24 (M384-tMEA-24W)	assione	OPT-24
Piattaforma Axion Edge MEA	assione	Maestro Edge
Matrice a membrana basale - Matrigel	Corning	354277	Dettagli nel protocollo
Microscopio da banco (sterile sotto cappa per colture cellulari)	Zeiss	Numero 415510-1100-000	Primo Vert
Fattore neurotrofico ciliare (CNTF)	Peprotech	450-13	Sciogliere 100 μg in 1 ml di PBS sterile, quindi aggiungere 9 ml di BSA-PBS sterile allo 0,1% a 10 μg/mL. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire a 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 10 ng/mL).
Serbatoi di CO2 e regolatore per Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
DMEM/F12	Thermofisher	Codice 113300	Concentrazione di lavoro 1x
Integratore Essential 8 Medium + Essential 8	Thermofisher	A1517001	Combinare 10 ml di integratore Essential 8 (10x) con 500 ml di terreno di crescita Essential 8 (1x)
Siero fetale bovino (FBS)	Thermofisher	16140071	Concentrazione di lavoro 1x
Emocitometro	Scienze della microscopia elettorale	Codice 63510-20
Incubatore per colture cellulari a umidità controllata	ThermoFisher	370	impostato a 37 ºC, 5 % CO2
Laminina	Thermofisher	Codice 23017-015	Soluzione madre 1 mg/mL, concentrazione di lavoro 10 μg/mL (rivestimento), 1 μg/mL (terreno cellulare)
L-Glutammina	Thermofisher	Codice 25030	Sciogliere 2 mg di LDN in 500 μL di cloroformio per ottenere 10 mM di stock. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Per l'uso, diluire prima il materiale da 1 a 10 in DMSO [a 1 mM], quindi diluire 1:5000 di 1 mM nel mezzo desiderato per ottenere una soluzione di lavoro di 0,2 μM
Lastre di vetro MEA	Sistemi multicanale	60MEA200/30iR-Ti-gr	Concentrazione di lavoro 100x
Pipetta multicanale P200	Gilson	PJ22224
Neurobasale	Thermofisher	21103049
Aminoacidi non essenziali (NEAA)	Thermofisher	11140050	Concentrazione di lavoro 1x
Matita/Streptomicina	Thermofisher	15140122	Concentrazione di lavoro 100x
Poliornitina (OLP)	Sigma-Aldrich	P3655	Concentrazione di lavoro 100x
Cloruro di potassio (KCl)	Na	Na	Sciogliere 100 mg in 1 mL di ddW per ottenere 100 mg/mL di soluzione madre. Aliquotare il brodo in provette da 100 μL. (concentrazione di lavoro 100 μg/mL)
Purmorfemina (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Concentrazione di lavoro100 mM
Inibitore di ROCK	Peprotech	1293823	Centrifugare brevemente prima della ricostituzione. Sciogliere 100 μg in 1 mL di PBS a 100 μg/mL, quindi aggiungere 9 mL di BSA-PBS sterile allo 0,1% a 10 μg/mL. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire a 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 10 ng/mL).
Cappe per colture cellulari sterili	Azienda Baker	Sg-600	Sciogliere 5 mg in 1480 μL di dH2O per ottenere 10 mM di stock, aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire a 1: 500 per l'uso. (concentrazione di lavoro 20 μM).
Supplemento B - Supplemento B27	Thermofisher	21985023
Centrifuga per colture cellulari da tavolo	ThermoFisher	75004261	Concentrazione di lavoro 50x
Film termoplastico - Parafilm	PARAFILM	P7793	Sorvall Leggenda X1R
Tripsina-EDTA (0,05%)	Thermofisher	2530054	Concentrazione di lavoro 1x
Bagno d'acqua	ThermoFisher	Codice 2332	Isotemp