Misurazione simultanea del calcio intracellulare e del potenziale di membrana in un endotelio cerebrale di topo

Abstract

Fonte: Hakim, M. A. et al. Misurazioni simultanee del calcio intracellulare e del potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale di topo appena isolato e intatto. J. Vis. Exp. (2019)

Il video dimostra la misurazione simultanea dei livelli intracellulari di calcio e delle variazioni del potenziale di membrana nelle cellule endoteliali dei segmenti dell'arteria cerebrale di topo. Il tubo endoteliale isolato viene caricato con un indicatore fluorescente di calcio e trattato con un farmaco che induce il rilascio intracellulare di calcio, con conseguente variazione del potenziale di membrana. La fluorescenza dell'indicatore consente la misurazione dei livelli di calcio e un elettrodo di registrazione viene inserito in una cella per misurare le variazioni del potenziale di membrana.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Dissezione e isolamento dell'arteria cerebrale

NOTA: Tutte le procedure di dissezione richiedono l'ingrandimento del campione (fino a 50x) tramite stereomicroscopi e l'illuminazione fornita da sorgenti luminose in fibra ottica. Per eseguire le procedure di dissezione per l'isolamento del cervello e delle arterie, utilizzare strumenti di dissezione affilati. Gli strumenti di microdissezione per isolare e pulire le arterie includono pinze affilate a punta fine e forbici da dissezione in stile Vannas (lame da 3 a 9,5 mm).

1. Isolamento del cervello di topo
   1. Anestetizzare un topo C57BL/6 (3-30 mesi; maschio o femmina) mediante inalazione di isoflurano (3% per 2-3 minuti), quindi decapitare l'animale immediatamente dopo la completa induzione dell'anestesia. Porre la testa in una capsula di Petri (diametro 10 cm, profondità 1,5 cm) contenente una soluzione salina fisiologica fredda (4 °C) di Ca²⁺ zero (PSS) sotto stereomicroscopio.
   2. Osservando attraverso il microscopio, rimuovere la pelle e i peli sopra il cranio e rimuovere il sangue in eccesso con freddo zero Ca²⁺ PSS. Praticare un'incisione utilizzando solo le punte delle forbici da dissezione standard (ad esempio, lama da 24 mm), iniziando dall'osso occipitale ed estendendosi fino all'osso nasale del cranio.
   3. Aprire con cura il cranio lungo l'incisione usando una pinza a punta grossa e separare il tessuto connettivo per isolare il cervello con un cerchio di Willis intatto><. NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare una pinza per tagliare le ossa Littauer per aprire il cranio ed esporre il cervello.
   4. Lavare delicatamente il cervello isolato con Ca²⁺ PSS freddo zero in un becher per rimuovere il sangue. Posizionare il lato ventrale del cervello rivolto verso l'alto in una camera contenente una soluzione di dissezione fredda per l'isolamento delle arterie cerebrali (Figura 1A).
2. Isolamento delle arterie cerebrali
   NOTA: L'arteria cerebrale posteriore è stata selezionata come modello di studio endoteliale cerebrovascolare rappresentativo per questo protocollo.
   1. Fissare il cervello isolato in soluzione di dissezione a freddo utilizzando perni di acciaio inossidabile (diametro 0,2 mm, lunghezza ~11-12 mm) da inserire in un polimero di silicio infuso di carbone che riveste il fondo (profondità ≥50 cm) di una capsula di Petri di vetro.
   2. Per mantenere una temperatura di raffreddamento di PSS durante la dissezione, utilizzare una camera di dissezione raffreddata da un sistema refrigerante che fa scorrere continuamente una miscela di acqua-glicole etilenico 1:1. In alternativa, la dissezione può essere eseguita su ghiaccio fresco.
   3. Isolare chirurgicamente le arterie cerebrali posteriori (segmenti da ~0,3 a 0,5 cm, nessuna tensione assiale) dalle arterie comunicanti posteriori e basilari utilizzando strumenti di microdissezione, forbici stile Vannas e pinze affilate a punta fine (Figura 1B). Utilizzare perni in acciaio inossidabile (diametro 0,1 mm, lunghezza ~13-14 mm) per fissare entrambe le arterie cerebrali posteriori isolate nella soluzione di dissezione nella capsula di Petri (Figura 1C).
   4. Pulire accuratamente le arterie cerebrali posteriori isolate rimuovendo il tessuto connettivo utilizzando una pinza affilata a punta fine (Figura 1D). Tagliare le arterie intatte in segmenti (lunghezza 1-2 mm) per la digestione enzimatica (Figura 1D; riquadro).

2. Preparazione del tubo endoteliale e superfusione

1. Preparare l'apparato di triturazione utilizzando un microscopio dotato di obiettivi (10x, 20x e 40x), una fotocamera e un tavolino in alluminio contenente una camera e micromanipolatori. Fissare una microsiringa con un controller della pompa adiacente al tavolino e al campione (Figura 2A).
2. Riempire completamente una pipetta per triturazione con olio minerale e fissarla sul pistone della microsiringa. Quindi, utilizzando la micro-siringa con controller a pompa, prelevare la soluzione di dissociazione nella pipetta (~130 nl) sopra l'olio minerale, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria nella pipetta.
3. Posizionare i segmenti arteriosi intatti in 1 mL di soluzione di dissociazione in una provetta di vetro da 10 mL (Figura 2B), contenente 0,31 mg/mL di papaina, 0,5 mg/mL di ditioeritritolo, 0,75 mg/mL di collagenasi e 0,13 mg/mL di elastasi. Incubare a 34 °C per 10–12 minuti per una digestione parziale.
4. Dopo la digestione, sostituire la soluzione enzimatica con ~5 ml di soluzione di dissociazione fresca. Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire un segmento in una camera contenente la soluzione di dissociazione a temperatura ambiente (RT).
5. Posizionare la pipetta nella soluzione di dissociazione nella camera e posizionarla vicino a un'estremità del recipiente digerito. Impostare una velocità compresa tra 2 e 5 nL/s sul controller della pompa per una triturazione delicata (Figura 2C; riquadro).
6. Durante la visualizzazione attraverso un ingrandimento da 100x a 200x, ritirare ed espellere il segmento arterioso per dissociare le cellule muscolari lisce producendo un tubo endoteliale. Se necessario, utilizzare con cautela una pinza a punta fine per separare l'avventizia dissociata e la lamina elastica interna dal tubo endoteliale. Confermare che tutte le cellule muscolari lisce sono dissociate e che solo le cellule endoteliali rimangono come un "tubo" intatto (Figura 2C).
7. Utilizzando micromanipolatori, fissare ciascuna estremità del tubo endoteliale sul vetrino di copertura della camera di superfusione utilizzando pipette di fissaggio in vetro borosilicato (Figura 2D).
8. Eliminare l'avventizia dissociata e le cellule muscolari lisce dalla camera e sostituire la soluzione di dissociazione con 2 mM di CaCl₂ PSS. Trasferire la piattaforma mobile con tubo endoteliale fissato sul microscopio di superfusione e sul banco sperimentale.
9. Utilizzare 6 serbatoi puliti da 50 ml (Figura 3A) per l'erogazione continua di PSS e rispettive soluzioni farmacologiche durante l'esperimento, a seconda dei casi. Utilizzare la valvola di controllo del flusso in linea per impostare manualmente la portata in modo coerente con il flusso laminare, abbinando l'alimentazione del flusso all'aspirazione del vuoto. Erogare PSS nella camera (Figura 3B) per la superfusione del tubo endoteliale per ≥ 5 minuti prima di registrare i dati di fondo e il carico del colorante.

3. Impostazioni del carico di colorante, del lavaggio e della temperatura

1. Accendere tutti i componenti del sistema di fotometria per la misurazione di [Ca²⁺]_i. Utilizzare il microscopio sul banco sperimentale (Figura 3C) per visualizzare il tubo endoteliale con un ingrandimento di 400x e mettere a fuoco le cellule nella finestra fotometrica utilizzando la suite software del sistema di fotometria.
2. Misurare il diametro del tubo endoteliale e registrare i valori di autofluorescenza di fondo in base all'emissione di 510 nm durante l'eccitazione alternata a 340 e 380 nm (≥10 Hz).
3. Per misurare le risposte intracellulari del Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i), caricare il tubo endoteliale con il colorante Fura-2 AM (estere Fura-2-acetossimetile, concentrazione finale di 10 μM) a RT e lasciare ~30-40 minuti in assenza di luce.
4. Riavviare la superfusione del tubo endoteliale con PSS fresco per ~30-40 minuti per eliminare il colorante in eccesso e consentire a Fura-2 AM intracellulare di de-esterificare. Durante il periodo di lavaggio, aumentare gradualmente la temperatura da RT a 37 °C utilizzando il regolatore di temperatura (Figura 3A) con un riscaldatore in linea, quindi mantenerla a 37 °C per tutta la durata dell'esperimento.
   nota: La transizione incrementale consigliata tra RT e 37 °C prevede tre fasi (ad esempio, 5 °C) con un tempo di equilibratura di ≥5 minuti ad ogni fase.

4. Misurazione simultanea di [Ca²⁺]_i e V_m

1. Accendere tutte le altre apparecchiature e la suite software dell'elettrometro per la misurazione del potenziale di membrana (V_m, vedere Figura 3, Figura 4). Regolare di conseguenza la velocità di acquisizione dei dati (≥10 Hz).
2. Estrarre un elettrodo affilato e riempire con 2 M KCl. Per gli studi sull'accoppiamento intercellulare tramite trasferimento di colorante, riempire i microelettrodi con ioduro di propidio allo 0,1% disciolto in 2 M KCl.
3. Fissare l'elettrodo su un filo d'argento rivestito di cloruro nel portapipette fissato a uno stadio della testa dell'elettrometro fissato con un micromanipolatore. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare brevemente la punta dell'elettrodo nel PSS che scorre nella camera mentre si osserva attraverso l'obiettivo 4x.
4. Impostare la V_m a riposo su 0 in modo coerente con il potenziale del bagno con messa a terra. Posizionare la punta dell'elettrodo appena sopra una cella del tubo endoteliale. Se lo si desidera, utilizzare monitor acustici di base collegati a elettrometri per associare l'altezza del suono a potenziali registrazioni.
5. Aumentare l'ingrandimento a 400x utilizzando l'obiettivo 40x e riposizionare la punta dell'elettrodo secondo necessità. Regolare la finestra fotometrica utilizzando il software di fotometria per concentrarsi su ~50-80 cellule endoteliali.
6. Posizionare delicatamente l'elettrodo in una delle cellule del tubo endoteliale utilizzando il micromanipolatore e attendere ≥2 minuti affinché il V_m a riposo si stabilizzi. Allo stesso modo, inserire un secondo elettrodo in un'altra cella (distanza ≥100 μm) dalla prima cella impalata con il primo elettrodo.
7. Una volta che V_m a riposo è stabile ai suoi valori attesi (da -30 a -40 mV), accendere il PMT sull'interfaccia di fluorescenza in assenza di luce e iniziare l'acquisizione di [Ca²⁺]_i intracellulare eccitando Fura-2 alternativamente (10 Hz) a 340 e 380 nm mentre raccoglie l'emissione di fluorescenza a 510 nm.
   NOTA: Per testare l'accoppiamento elettrico intercellulare, la corrente (± 0,5-3 nA, durata dell'impulso ~20 s) può essere erogata tramite un elettrometro come "Sito 1" e le variazioni di V_m possono essere registrate con un altro elettrometro come "Sito 2" (distanza ≥100 μm).
8. Una volta stabilite le misurazioni simultanee di V_m e [Ca²⁺]_i, attendere ~5 min per la superfusione del tubo endoteliale con PSS a una velocità di flusso laminare costante prima dell'applicazione dei farmaci.
9. Applicare il farmaco (ad es. adenosina trifosfato [ATP]) preparato in PSS nella camera di superfusione con la velocità di flusso costante. Dopo ~3 minuti (o un periodo di tempo appropriato per la cinetica del farmaco), lavare con PSS fino a quando V_m e il rapporto F₃₄₀/F₃₈₀ tornano alle loro condizioni basali. Contrassegnare le rispettive registrazioni come temporalmente sincronizzate tra le suite software di fotometro ed elettrometro durante ogni transizione di soluzioni.
10. Una volta terminato l'esperimento, estrarre l'elettrodo dalla cella utilizzando il micromanipolatore e notare V_m ~0 mV come indicato dall'elettrodo del bagno. Interrompere le rispettive registrazioni di V_m e [Ca²⁺]_i e salvare le registrazioni su file per l'analisi dei dati.

Risultati

Figura 1: Isolamento dell'arteria cerebrale dal cervello. (A) Cervello isolato con arterie intatte (la freccia bianca indica l'arteria cerebrale posteriore) in soluzione di dissezione. (B) Vista ingrandita dell'arteria cerebrale posteriore (freccia bianca; ~3x vs.Pannello A). (C) Arterie cerebrali posteriori isolate fissate con perni di acci...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
glucosio	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Stati Uniti)	G7021
NaCl	sigma	S7653
MgCl2	sigma	Motore M2670
CaCl2	sigma	223506
HEPES	sigma	H4034
Kcl	sigma	P9541
NaOH	sigma	S8045
ATP	sigma	Codice: A2383
Hcl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, Stati Uniti)	A466250
Collagenasi (miscela di tipo H)	sigma	Visualizzazione del materiale C8051
Ditioeritritolo	sigma	D8255
papaina	sigma	P4762
elastasi	sigma	E7885
Bsa	sigma	Codice: A7906
Ioduro di propidio	sigma	P4170
Dmso	sigma	D8418
Colorante Fura-2 AM	Invitrogen, Carlsbad, CA, Stati Uniti	F14185
Refrigeratore a ricircolo (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientifico	13874647
Camera di superfusione in plexiglas	Warner Instruments, Camden, CT, Stati Uniti	RC-27
Fondo vetrino coprioggetti (2,4 × 5,0 cm)	ThermoFisher Scientifico	12-548-5M
Piattaforma in alluminio anodizzato (diametro: 7,8 cm)	Strumenti Warner	PM6 o PH6
Tavolino compatto in alluminio	Siskiyou, Grants Pass, OR, Stati Uniti	8090P
Micromanipolatore	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopi	Zeiss, NY, Stati Uniti	Stemi 2000 & 2000-C
Sorgenti luminose in fibra ottica	Schott, Magonza, Germania e KL200, Zeiss	Fostec 8375
Microscopio invertito Nikon	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, Stati Uniti	Ts2
Obiettivi a contrasto di fase	Strumenti Nikon Inc	(Ph1 DL; 10X e 20X)
Obiettivi fluorescenti	Strumenti Nikon Inc	20X (S-Fluor) e 40X (Plan Fluor)
Microscopio invertito Nikon	Strumenti Nikon Inc	Eclipse TS100
Controllore per micropompe a siringa (Micro4 )	Strumenti di precisione mondiali (WPI), Sarasota, FL, Stati Uniti	SYS-MICRO4
Tabella di isolamento dalle vibrazioni	Produzione tecnica, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplificatori	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Stati Uniti	Axoclamp 2B e Axoclamp 900A
Headstage	Dispositivi molecolari	HS-2A e HS-9A
Generatore di funzioni	EZ Digital, Seoul, Corea del Sud	FG-8002
Sistema di acquisizione dati	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Stati Uniti	Digidata 1550A
Monitor di base acustici	Ampol US LLC, Sarasota, FL, Stati Uniti	BM-A-TM
Oscilloscopio a memoria digitale	Tektronix, Beaverton, Oregon, Stati Uniti	TDS 2024B
Interfaccia sistema a fluorescenza, lampada ARC + alimentatore, hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Stati Uniti	Sistemi IonOptix
Regolatore di temperatura	Strumenti Warner	TC-344B o C
Riscaldatore in linea	Strumenti Warner	SH- 27B
Regolatore della valvola	Strumenti Warner	VC-6
Valvola di controllo del flusso in linea	Strumenti Warner	FR-50
Estrattore elettronico	Sutter Instruments, Novato, CA, Stati Uniti	P-97 o P-1000
Microforgia	Narishige, East Meadow, NY, Stati Uniti	MF-900
Tubi in vetro borosilicato (triturazione)	Strumenti di precisione mondiali (WPI), Sarasota, FL, Stati Uniti	1B100-4
Tubi in vetro borosilicato (pinning)	Strumenti Warner	G150T-6
Tubi in vetro borosilicato (elettrodi affilati)	Strumenti Warner	GC100F-10
Filtro per siringa (0,22 μm)	ThermoFisher Scientifico	722-2520
Piastra di Petri in vetro + carbone Sylgard	Strumentazione per sistemi viventi, città di St. Albans, VT, Stati Uniti	DD-90-S-BLK
Forbici stile Vannas (3 mm e 9,5 mm)	Strumenti di precisione mondiali	555640S, 14364
Forbici con lame da 3 e 7 mm	Strumenti di scienze fini (o FST), Foster City, CA, Stati Uniti	Moria MC52 e 15000-00
Pinze affilate a punta fine	FST	Dumont #5 e Dumont #55