Valutazione della formazione di connessioni neurali in una co-coltura utilizzando registrazioni elettrofisiologiche

Abstract

Fonte: Su, C. T. E., et al. Un approccio optogenetico per valutare la formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura. J. Vis. Exp. (2015)

Il video dimostra la registrazione elettrofisiologica per valutare le connessioni neurali tra i neuroni derivati da iPSC e corticali di ratto, confermando i contatti sinaptici nella co-coltura attivando canali ionici sensibili alla luce e rilevando correnti postsinaptiche.

Protocollo

1. Registrazioni elettrofisiologiche di neuroni derivati da iPSC

1. Confermare se le iPSC umane si comportano come neuroni maturi.
   1. Trova le cellule differenziate dalle iPSC umane mediante la visualizzazione di tdTomato utilizzando un microscopio confocale verticale dotato di una lente a immersione in acqua 60X (0,9 NA).
   2. Tirare la pipetta di registrazione a una resistenza compresa tra 4 e 6 M. Perfondere le celle a temperatura ambiente in una soluzione esterna gorgogliata costantemente con il 95% di O₂/ 5% di CO₂. Riempire la micropipetta di registrazione con la soluzione interna.
   3. Applicare patch alla cella tdTomato+ in modalità cella intera e registrare l'attivazione del potenziale d'azione in risposta all'iniezione di corrente (durata di 1 secondo, incrementi di 10 pa) nella pinza amperometrica.
2. Confermare se il potenziale d'azione delle cellule corticali che esprimono ChR2 è evocato in modo affidabile dalla stimolazione luminosa.
   1. Trova le cellule corticali che esprimono ChR2 visualizzando la GFP al microscopio confocale. Eseguire la registrazione del patch clamp su cellule intere sulle cellule corticali seguendo i passaggi da 1.1.2 a 1.1.3.
   2. Verificare che il potenziale d'azione sia evocato in modo affidabile dall'illuminazione della luce con una lampada ad arco di mercurio (100 W). La lunghezza d'onda del filtro di eccitazione è di 480/40 nm.
3. Eseguire la stimolazione optogenetica.
   1. Applicare la patch alla cella tdTomato+ in modalità cella intera e impostare il morsetto di tensione a -70 mV. Filtra i segnali di corrente a 2 kHz e digitalizza a 10 kHz. Monitora le resistenze in serie che vanno da 10 a 20 M per garantire uniformità durante le registrazioni.
   2. Stimolare l'intero campo con una lampada al mercurio da 100 W con filtro di eccitazione da 480/40 nm per 30 sec.
   3. Registrare le correnti postsinaptiche (PSC) di cellule patchate indotte dalla fotostimolazione dei neuroni corticali presinaptici che esprimono ChR2. Rileva e misura le PSC.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaCl	sigma	S7653
Kcl	sigma	P5405
NaHCO3	sigma	Episodio 5761
NaH2PO4	Fluka	Codice: 71505
MgCl2	sigma	Codice: M8266
CaCl2	sigma	Visualizzazione del materiale C1016
D(+)-glucosio	sigma	G7520	Per studi elettrofisiologici
K-gluconato	sigma	P1847
Koh	KANTO Chimico	Codice 3234400
HEPES	sigma	H3375	Per studi elettrofisiologici
EGTA	sigma	E3889
Na2ATP	sigma	Codice: A7699
Na3GTP	sigma	G8877
Capillari in vetro borosilicato	Strumenti di precisione mondiali, Inc	1604323
Lampada ad arco corto al mercurio	OSRAM	HBO 103 V / 2