Imaging della segnalazione del calcio indotta dalla nicotina lungo gli assoni dell'ippocampo ventrale in co-colture sinaptiche

Abstract

Fonte: Zhong, C., et al., Imaging dal vivo della segnalazione del calcio indotta dalla nicotina e dal rilascio di neurotrasmettitori lungo gli assoni dell'ippocampo ventrale. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra come l'attivazione mediata dalla nicotina dei recettori nicotinici dell'acetilcolina nell'ippocampo ventrale del topo si traduca in una segnalazione sostenuta del calcio lungo gli assoni.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Imaging del calcio

1. Sciacquare rapidamente le colture (5 - 7 giorni in vitro) con HBS normale, quindi caricare le colture con 5 μM di Fluo-4 Ca²⁺ indicatore (estere AM) e 0,02% di Pluronic F-127 in HBS (2 ml) per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO₂.
2. Lavare la soluzione di Fluo-4 con HBS (3 volte/5 min). Rimettere le colture nell'incubatore (37 °C / 5% CO₂) per almeno 30 minuti.
3. Conservare le colture (5 - 7 giorni in vitro) in una camera di imaging e montare la camera su un microscopio confocale a disco rotante. Perfondere in continuo (1 ml/min) con il cocktail HBS a RT.
4. Raccogli immagini in fluorescenza Fluo-4 di proiezioni assonali dalle micro-fette vHipp con un obiettivo Plan-Apochromat (acqua 60X con 1.4 NA, eccitazione 488 nm, emissione 530 nm) e una telecamera CCD.
5. Raccogli le immagini di fluorescenza Fluo-4 di base (ogni 10 secondi per 2 minuti) come controllo pre-nicotina. Applicare nicotina (1 μM) per perfusione rapida (2 ml/min) per 1 minuto, quindi lavare la nicotina con un cocktail HBS. Continua a catturare immagini time-lapse prima, durante e dopo l'applicazione di nicotina ogni 10 secondi per 30 minuti.
6. Salva tutti i fotogrammi delle immagini grezze in fluorescenza fluo-4 ed esportali come una serie di immagini TIFF per ulteriori analisi.
7. Raccogliere l'intensità integrata della fluorescenza fluo-4 lungo gli assoni vHipp prima e dopo l'applicazione di nicotina.
8. Normalizzare l'intensità della fluorescenza integrata con la seguente equazione: ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀, dove F₀ è l'intensità della fluorescenza integrata pre-nicotina corretta per lo sfondo e F è l'intensità della fluorescenza integrata lungo gli assoni vHipp in ogni punto temporale dopo l'applicazione della nicotina. Analizza e traccia l'intensità della fluorescenza integrata normalizzata.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cocktail HBS per l'imaging dal vivo pH=7,3
NaCl	sigma	S9888	135 mM
Kcl	sigma	P9333	5 mM
cloruro di magnesio	sigma	Codice: M8266	1 mM
cloruro di calcio	sigma	Visualizzazione del materiale C1016	2 mM
HEPES	sigma	H3375	10 mM
glucosio	sigma	G0350500	10 mM
Tetrodotossina	Tocris	Codice: 1078	2 μM
Bicucullina	Tocris	131	10 μM
D-AP-5	Tocris	105	50 μM
CNQX	Tocris	Codice: 1045	20 μM
LY341495	Tocris	Codice: 1209	10 μM