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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Denervazione chirurgica
- Iniettare la soluzione anestetica per via intraperitoneale alla dose di 200 μl per 20 g di peso corporeo del topo. Verificare che l'animale abbia raggiunto il corretto piano di sedazione mediante il test di pizzicamento delle dita dei piedi e confermare che la frequenza cardiaca e respiratoria siano normali (rispettivamente circa 600 battiti e 160 respiri al minuto).
- Preparare l'area chirurgica della pelle posteriore utilizzando Betadine e salviettine imbevute di alcol e coprire l'animale con un telo chirurgico sterile (a scopo dimostrativo, il telo sterile è stato omesso per aumentare la visibilità). Mantenere l'animale al caldo utilizzando un termoforo mentre si opera in un'area chirurgica asettica.
- Fai un'incisione usando un bisturi sterile #11 lungo la linea mediana dorsale dalla base del collo a circa 0,5 cm sopra la coda.
- Usando una pinza smussata, rifletti delicatamente la pelle sul lato sinistro lontano dal fianco per visualizzare il tessuto sottostante dai cuscinetti adiposi scapolari vicino al collo fino a appena sopra l'arto posteriore.
nota: I nervi cutanei dorsali appaiono come filamenti bianchi che viaggiano caudalmente attraverso la fascia traslucida della parete del tronco prima di fare curve brusche ed entrare nel tessuto connettivo lasso sotto la pelle (Figura 1).
- Utilizzando una pinza ultrasottile al microscopio ottico da dissezione, rimuovere i nervi esclusivamente dal lato sinistro dell'animale situato nei siti anatomici T3-12 strappando dal punto in cui i segmenti si piegano sulla parete del tronco fino ai loro siti di ingresso nella pelle (Figura 1).
- Orientare la pinza verticalmente e rimuovere i nervi afferrando circa 0,5 cm sotto i loro siti di piegatura e tirando verso l'alto, provocando l'allungamento e la separazione del nervo dal tessuto circostante (Figura 1C-E). Fare attenzione a evitare di rompere i vasi sanguigni adiacenti.
- Continuare fino a quando tutti i nervi che si estendono dalla parete del tronco alla pelle sono stati rimossi. Non interrompere i nervi all'interno della fascia densa della parete del tronco. Mantenere il tessuto umido durante tutta la procedura applicando periodicamente gocce di soluzione salina sterile allo 0,9%.
- In alternativa, rimuovere i nervi afferrando le loro estremità prossimali vicino alla parete del tronco con una pinza e tagliando con le forbici sottili. Successivamente, recidere le estremità distali vicino alla pelle (Figure 1F-H). Infine, rimuovere i segmenti nervosi intermedi (Figura 1I).
- Rimuovere eventuali nervi dal lembo cutaneo esposto al passaggio 1.4. Queste fibre comprendono i rami distali dei nervi cutanei dorsali e appaiono come filamenti ramificati bianchi situati sporadicamente all'interno del tessuto connettivo sul lato dermico del lembo cutaneo (Figure 1J-K).
- Per rimuovere questi rami sottili, posizionare la pinza sottile approssimativamente parallela alla superficie dermica, afferrare i nervi e strappare verso l'alto per evitare di rompere i vasi sanguigni e perforare la pelle. Continuare fino a quando tutti i nervi visibili sono stati rimossi.
- Usando la dissezione smussata, riflettere la pelle sul lato destro dell'incisione della linea mediana dorsale, ma non rimuovere i nervi. Questo servirà come controllo controlaterale azionato da sham.
- Sutura lungo la linea mediana dorsale in un semplice schema interrotto per chiudere l'incisione utilizzando suture di nylon 6-0, in un semplice schema interrotto distanziati di circa 3 mm l'uno dall'altro.
- Non riportare i topi che hanno subito un intervento chirurgico nella stessa gabbia di altri animali fino a dopo il completo recupero.
- Monitorare gli animali immediatamente dopo l'intervento chirurgico fino a quando non riprendono conoscenza e anche quotidianamente fino a quando l'area chirurgica non è guarita, in genere entro 1 settimana. Utilizzare analgesici in conformità con le linee guida istituzionali designate per la cura degli animali e l'uso se i topi mostrano segni di dolore o angoscia. Rimuovere i punti di sutura entro 7-10 giorni dall'intervento. nota: Se necessario, preparare una soluzione analgesica diluendo il carprofene (50 mg/ml di soluzione madre) 1:100 in acqua sterile. Iniettare la soluzione per via sottocutanea tra le scapole vicino alla collottola, alla dose di 200 μl per 20 g di peso corporeo (5 mg/kg di peso corporeo del topo).
- Per valutare funzionalmente la denervazione stabile fino a diverse settimane dopo l'intervento chirurgico, rimuovere i peli dalla cute dorsale utilizzando un tagliacapelli elettrico.
- Pungere delicatamente l'area della pelle denervata usando un ago ipodermico e notare se l'animale risponde, in genere rabbrividendo o girando la testa. Se l'area della pelle è stata denervata in modo stabile, l'animale mostrerà poca o nessuna risposta.
