Studio del postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) nei fotorecettori della Drosophila

Abstract

Fonte: Gutorov, R., et al. Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video dimostra un protocollo sperimentale per studiare il post-potenziale depolarizzante prolungato (PDA) nella Drosophila dagli occhi bianchi. L'occhio della mosca è esposto a intensi impulsi di luce blu per convertire il fotopigmento rodopsina in metarodopsina, avviando una cascata di segnalazione che apre canali ionici positivi e provoca la depolarizzazione della membrana. Poiché la luce blu impedisce la riconversione della metarodopsina in rodopsina, l'afflusso continuo di ioni positivi provoca una depolarizzazione prolungata, nota come potenziale di depolarizzazione prolungato (PDA).

Protocollo

1. Misurazione del postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) utilizzando l'elettroretinogramma

1. Condizioni di allevamento adatte per la preparazione di Drosophila melanogaster
   1. Allevare mosche D. melanogaster in bottiglie contenenti mais giallo standard contenente cibo in un'incubatrice mantenuta a una temperatura di 24 °C e in un ciclo buio/luce di 12 ore.
   2. Tenere le bottiglie al buio almeno 24 ore prima dell'esperimento.
2. Configurazione generale
   1. Preparare le pipette di registrazione tirando i capillari in vetro borosilicato riempiti con fibra da 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) (Figura 1L, O). La resistenza delle pipette deve essere di 5-10 MΩ; È possibile utilizzare qualsiasi estrattore adatto.
   2. Rivestire due fili d'argento con AgCl₂, inserendo un filo d'argento da 0,25 mm in una soluzione KCl da 3 M collegata a un alimentatore da 5 V su misura.
   3. Inserire ciascun filo d'argento rivestito nei portaelettrodi (Figura 1N).
   4. Riempire il capillare di vetro con la soluzione filtrata di Ringer (vedere Tabella 1) utilizzando una siringa con punta allungata (Figura 1M).
   5. Inserire l'elettrodo a filo nel capillare di vetro. Assicurarsi che la soluzione all'interno del capillare sia a contatto con il filo d'argento.
   6. Inserire i portaelettrodi (Figura 2P, N) nei due micromanipolatori di elettrodi (Figura 2G).
3. Procedura di preparazione della mosca per le registrazioni elettriche
   NOTA: Per mantenere la mosca in condizioni di adattamento al buio, utilizzare solo una luce rossa fioca durante i passaggi seguenti.
   1. Anestetizzare le mosche nella bombola con gas CO₂ utilizzando il sistema fly sleeper (Figura 1A, B) e versarle nel contenitore della traversina.
   2. Scegli una mosca e tienila con cura per l'ala usando una pinzetta affilata. Copri il resto delle mosche con una capsula di Petri.
   3. Posizionare la mosca sul supporto della mosca con l'orientamento corretto, sdraiata su un lato, con la parte posteriore rivolta verso la mano (Figura 1P).
   4. Accendere l'alimentazione del saldatore. Impostare la corrente su ~2,25 A. Questa corrente dovrebbe riscaldare il filamento di platino-iridio da 0,25 mm a ~55-56 °C.
   5. Posizionare una goccia di cera a bassa temperatura di fusione (~55-56 °C) sul saldatore (Figura 1F).
   6. Usando una pinzetta, sollevare la mosca dalle ali e fissarla al supporto della mosca (Figura 1I) usando il saldatore.
   7. Utilizzando il saldatore, collegare la parte posteriore della mosca alla superficie del supporto con la cera (Figura 1P).
   8. Abbassare la punta del saldatore sul punto di giunzione delle gambe e sciogliere la cera per coprire tutte le gambe insieme (Figura 1P).
   9. Mettere una piccola goccia di cera tra la testa e la schiena nella zona del collo (Figura 1P).
      NOTA: Prestare particolare attenzione per evitare il surriscaldamento della testa della mosca. Assicurarsi che la mosca sia fissata correttamente e non sia in grado di muoversi durante l'esperimento; Piccoli movimenti possono creare artefatti nelle registrazioni. Assicurarsi che le aperture della trachea (prese d'aria) nel torace e nell'addome non siano ricoperte di cera.
   10. Posizionare il supporto per mosche (Figura 2Q) in una gabbia di Faraday buia su un blocco magnetico (Figura 2I) e assicurarsi che la mosca sia a ~5 mm dall'estremità della guida luminosa (Figura 2L).
   11. Posizionare l'elettrodo di registrazione (Figura 2P) sopra l'occhio della mosca e l'elettrodo di terra (Figura 2N) sopra la parte superiore della schiena della mosca utilizzando i micromanipolatori.
   12. Inserire l'elettrodo di terra nella parte posteriore della mosca utilizzando i micromanipolatori.
   13. Inserire l'elettrodo di registrazione nella periferia esterna dell'occhio della mosca, preferibilmente utilizzando micromanipolatori.
       nota: Dopo aver inserito l'elettrodo nell'occhio, si osserverà una piccola fossetta; Tirare l'elettrodo verso l'alto senza rimuoverlo dall'occhio fino a quando la fossetta scompare. Gli elettrodi possono anche essere immersi in piccole goccioline di gelatina per elettrodi applicate sul busto e sull'occhio.
4. Protocollo PDA (questo protocollo può essere eseguito solo su mosche dagli occhi bianchi)
   1. Emette un impulso luminoso di 5 s di massima intensità utilizzando un filtro arancione (filtro a 590 bordi, per convertire il fotopigmento massimo allo stato R).
   2. Sostituire il filtro arancione con un filtro blu a banda larga (BP450/40 nm) ed emettere tre impulsi luminosi di 5 s alla massima intensità.
      NOTA: È anche possibile emettere un lungo impulso continuo di luce blu di massima intensità fino al raggiungimento di una risposta di tensione in stato stazionario.
   3. Attendere 60 s al buio, sostituire il filtro blu con il precedente filtro arancione ed emettere due impulsi luminosi di 5 s con intervalli di 60 s.

Tabella 1: Composizione della soluzione di Ringer

La soluzione di Ringer
Reagente	Concentrazione (mM)
NaCl	130
Kcl	numero arabo
MgCl2	5
CaCl2	numero arabo
HEPES	10
Titolazione del pH a 7,15 con NaOH e HCl

Risultati

Figura 1: Strumenti e dispositivi necessari per la fissazione delle mosche e la registrazione della preparazione delle pipette. (A) Sistema di traversine volanti; (B) Pedale del sistema Fly Sleeper; (C) Sorgente di luce fredda; (D) Microscopio stereoscopico; (E) Riscaldatore di filamenti di cera; (F) saldatore; (G) Pedale riscaldatore filamento di cera; (H) pinzette ruvide; (I) Cavalletto magnetico; ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 1 mL con punta allungata			Figura 1M
1 pinzetta ruvida		Dumont #5, Standard	0,1 mm x 0,06 mm, lunghezza 110 mm, Inox (Figura 1H)
2 lenti a condensatore
Convertitore A/D	Dispositivo molecolare	Digidata 1200	Possibile sostituzione: qualsiasi digidata da dispositivi molecolari (es. 1440A) - Figura 2C
amplificatore	Elettronica quasi perfetta		Possibile sostituzione: Warner instruments - IE251A o IE-210 (viene fornito con headstage) - Figura 2D
Tavolo antivibrante	Newport	VW-3036-OPT-01	Figura 7H
Capillari	Apparato di Harvard	Capillari in vetro borosilicato	1 mm x 0,58 mm (Figura 1O)
Morsetto	Dispositivo molecolare		software
Serbatoio CO2
Sorgente di luce fredda	Schott	KL1500 LCD	Figura 1C
Tergicristalli delicati	Kimtech		Salviette Kimwipes (Figura 1K)
Porta elettrodo			Adatto per diametro esterno capillare di 1 mm (Figura 1N, Figura 2N e Figura 2P)
gabbia di Faraday	Fatto in casa		Schermatura dal rumore elettromagnetico e tendina frontale nera (Figura 2K)
Filtro (colore)	Schott	OG590, Filtro perimetrale	Figura 2S
Filtro (colore)	Schott	BP450/40 nm	Figura 2S
Filtro (colore)	Blazer	550 nm	Figura 2S
Filtro (colore) per sorgente di luce fredda	Schott	Motore RG630	Figura 1C
Filtro (calore)	Schott	KG3	Figura 1S
Filtri (filtro a densità neutra)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figura 2S
Sistema di lampade Flash	Honeywell		Figura 2U
Sistema di traversine al volo con iniettore	Iniezione + matic		Figura 1A-B
Alimentazione della lampada	Pti	LPS-220	Figura 2W
Rilevatore di luce	Fatto in casa		Fototransistor (Figura 2O)
Guida luminosa			Diametro 3 mm, lunghezza 1,3 m (Figura 2L,M)
sorgente luminosa			Lampada allo xeno da 75 W ad alta pressione senza ozono (funzionante con 50 W), possibile sostituzione: Cairn research- OptoLED (Figura 7R)
Cera fondente a bassa temperatura	Fatto in casa		Composto da una miscela di cera d'api (Tm≈62 °C) e paraffina a ~3:1 per raggiungere una temperatura di fusione di ~55-56 °C (Figura 6J)
Supporto magnetico per mosche	Fatto in casa		Figura 1I e Figura 2Q
Sistema di preamplificazione a microelettrodi con stadio di testa	Elettronica quasi perfetta		Tester di impedenza (Figura 2G)
Micromanipolatore (meccanico grossolano)	Ricerca Tritech, Narishige	M-2
Micromanipolatore (meccanico fine)	Leitz Microsystems	Micromanipolatore meccanico Leitz	Figura 2F
pCLAMP	Dispositivo molecolare		software
Petri			60 millimetri
Generatore di impulsi	AMPI	Maestro 8	Figura 2A
Crema Redux per elettrocardiografia	Laboratori Parker	Redux Crema Elettrolitica
Driver dell'otturatore	Uniblitz, Vincent Associati	VCM-D1 Uni-stabile a canale singolo	Figura 2V
Sistema di persiane	Uniblitz, Vincent Associati	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figura 2V
Filo d'argento	Strumenti Warner		diametro 0,25–1 mm, deve essere clorurato
Saldatore composto da un filamento di platino-iridio			Diametro 0,25 mm (Figura 2F)
Microscopio zoom stereoscopico	Nikon	SMZ-2B	Figura 1D
Microscopio zoom stereoscopico	selvaggio	Selvaggio M5	Con impostazioni di ingrandimento 6, 12, 25 e 50 (Figura 2E)
Filtri per siringhe	Millex		Filtro PVDF da 22 μm
Estrattore per pipette verticale	Sutter/ Narishige	Modello P-97/PP-830	Utilizzare l'estrattore verticale o orizzontale, a seconda delle preferenze (Figura 1L)
Riscaldatore di filamenti di cera	Fatto in casa		Figura 1E-G
Sistema di lampade flash allo xeno	Dr. Rapp Optoelettronico	JML-C2	Figura 2X